Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio
Summary
La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.
Abstract
Los eventos de dimerización de proteínas que se producen sólo en presencia de un ligando de moléculas pequeñas permiten el desarrollo de biosensores de moléculas pequeñas para la disección y manipulación de vías biológicas. Actualmente, sólo existe un número limitado de sistemas de dimerización inducida químicamente (CID) y la ingeniería de otros nuevos con sensibilidad y selectividad deseadas para ligandos específicos de moléculas pequeñas sigue siendo un desafío en el campo de la ingeniería de proteínas. Aquí describimos un método de cribado de alto rendimiento, combin binders-enabled selección de CID (COMBINES-CID), para la ingeniería de novo de sistemas CID aplicables a una gran variedad de ligandos. Este método utiliza la selección en dos pasos de una biblioteca combinatoria nanobody mostrada por fago para obtener 1) “aglutinantes de anclaje” que primero se unen a un ligando de interés y luego 2) “aglutinantes de dimerización” que solo se unen a los complejos de anglutinante-ligando. Para seleccionar aglutinantes de anclaje, una biblioteca combinatoria de más de 109 nanocuerpos aleatorizados de región determinante de complementariedad (CDR) se examinan con un ligando biotinilado y los hits se validan con el ligando sin etiquetar mediante interferometría de capa biológica (BLI). Para obtener aglutinantes de dimerización, la biblioteca de nanobody se analiza con complejos de anclarios de anclaje como objetivos para el cribado positivo y los aglutinantes de anclaje no enlazados para el cribado negativo. COMBINES-CID es ampliamente aplicable a aglutinantes de CID seleccionados con otras inmunoglobulinas, no inmunoglobulina o andamios diseñados computacionalmente para crear biosensores para la detección in vitro e in vivo de fármacos, metabolitos, moléculas de señalización, etc.
Introduction
Los sistemas CID, en los que dos proteínas dimerize sólo en presencia de un ligando de moléculas pequeñas(Figura 1),ofrecen herramientas versátiles para disecar y manipular vías metabólicas, de señalización y otras vías biológicas1. Han demostrado el potencial en el accionamiento biológico, como la activación de células T controlada por fármacos2 y la apoptosis3,4,para mejorar la seguridad y eficacia de la terapia adoptiva de células T. Además, proporcionan una nueva metodología para la detección in vivo o in vitro de objetivos de moléculas pequeñas. Por ejemplo, las proteínas CID pueden fusionarse genéticamente con sistemas de reporteros de fluorescencia (por ejemplo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)5 y proteínas fluorescentes permutadas circularmente)6 para mediciones in vivo en tiempo real, o servir como reactivos de afinidad para ensayos similares a inmunoabsorbentes ligados a enzimas sándwich (ELISA).
A pesar de sus amplias aplicaciones, la creación de nuevos sistemas CID que pueden ser controlados por un ligando de moléculas pequeñas determinado tiene grandes desafíos. Los métodos establecidos de ingeniería de aglutinantes de proteínas, incluida la inmunización animal7, la selección in vitro8,9,y el diseño de proteínas computacionales10 pueden generar proteínas de unión de ligando que funcionan a través de interacciones binarias proteína-ligand. Sin embargo, estos métodos tienen dificultades para crear un complejo de CID ternario inducido por ligando. Algunos métodos crean CID mediante la vinculación química de dos ligandos que se unen de forma independiente a las mismas o diferentes proteínas11,12,13,14,15,16 o dependen de la selección de proteínas aglutinantes como anticuerpos dirigidos a pequeños complejos de moléculas-proteínas preexistentes17,18, y por lo tanto tienen una opción limitada de ligandos.
Recientemente desarrollamos un método de ingeniería denovo de los sistemas CID19. Este método puede obtener la alta especificidad de la dimerización inducida por ligando (por ejemplo, una constante de disociación de aglutinante de anclaje-dmerización, KD (sin ligando) /KD (con ligando) > 1.000). La especificidad de la dimerización se logra utilizando aglutinantes de anclaje con sitios de unión flexibles que pueden introducir cambios de conformación sobre la unión de ligandos, proporcionando una base para la selección de aglutinantes selectivos de conformación que sólo reconocen aglutinantes de anclaje ligandos. Demostramos una prueba de principio mediante la creación de heterodímeros inducidos por cannabidiol (CBD) de nanocuerpos, un fragmento de anticuerpo funcional de 12-15 kDa de camión que comprende un andamio universal y tres bucles CDR flexibles(Figura 2)20,que pueden formar un bolsillo de unión con tamaños adaptables para epítopos de moléculas pequeñas21,22. En particular, la selección in vitro de una biblioteca de proteínas combinatorias debe ser rentable y generalizable para la ingeniería CID, ya que la misma biblioteca de alta calidad se puede aplicar a diferentes ligandos.
En este protocolo y vídeo, nos centramos en describir la selección y validación in vitro en dos pasos del anclaje(Figura 3A)y los aglutinantes de dimerización(Figura 3B)mediante la selección de la biblioteca combinatorial de nanobody con una diversidad superior a 109 utilizando el CBD como objetivo, pero el protocolo debe ser aplicable a otras bibliotecas de proteínas o objetivos de moléculas pequeñas. El cribado de aglutinantes CID suele tardar de 6 a 10 semanas(Figura 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Es fundamental elegir las concentraciones correctas de las bibliotecas de fagos de entrada para diferentes rondas de bioparnning. Por lo general, comenzamos a partir de una biblioteca de entrada de 10a 12–10 13 partículas de fago con una diversidad >109,lo que permite que se presenten en el ensayo desplegable las copias de cada clon de fago. Si la concentración de fago en un ensayo de unión es demasiado alta o baja, la probabilidad de unión inespecífica o pérdida de clones positiv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio a la Innovación de la Universidad de Washington (a L.G.), una subvención de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (1R35GM128918 a L.G.), y un fondo de inicio de la Universidad de Washington (a L.G.). H.J. fue apoyado por una beca de pregrado de la Washington Research Foundation. K.W. fue apoyado por una beca de pregrado del Instituto de Diseño de Proteínas de la Universidad de Washington.
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
Referências
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