Skapa kemiskt inducerad proteindimerization system med önskad tillhörighet och specificitet för en given liten molekyl ligand skulle ha många biologiska avkänning och aktiverings applikationer. Här beskriver vi en effektiv, generaliserbar metod för de Novo Engineering av kemiskt inducerade dimeriseringssystem via det stegvisa urvalet av ett fag-visat kombinatoriskt endomänsantikroppsbibliotek.
Protein Dimerization händelser som förekommer endast i närvaro av en liten molekyl ligand möjliggöra utveckling av små molekyler biosensorer för dissektion och manipulation av biologiska vägar. För närvarande finns endast ett begränsat antal kemiskt inducerade Dimerization (CID) system och tekniska nya med önskad känslighet och selektivitet för specifika små-molekyl ligander fortfarande en utmaning inom området för proteinteknik. Vi beskriver här en hög genomströmning screeningmetod, combinatorial binders-eNABLED sval av Cid (kombinerar-CID), för de Novo Engineering av CID-system som gäller för en stor variation av ligander. Den här metoden använder två-stegs val av en FAGE-visas kombinatoriska nanobody bibliotek för att få 1) “Anchor bindemedel” som först binder till en ligand av intresse och sedan 2) “Dimerization bindemedel” som bara binder till ankare bindemedel-ligand komplex. För att välja ankare bindemedel, ett kombinatoriskt bibliotek med över 109 komplementaritetskontrollerande region (CdR)-randomiserade nanoorgan screenas med en en ligand och träffar valideras med omärkta ligand av bio-Layer interferometri (bli). För att erhålla dimeriseringsbindemedel screenas nanobodys bibliotek med ankare-ligand-komplex som mål för positiv screening och obundna förankrings bindemedel för negativ screening. Kombinerar-Cid är i stort sett tillämplig på utvalda CID bindemedel med andra immunglobulin, icke-immunglobulin, eller beräkningsmässigt utformade ställningar för att skapa biosensorer för in vitro-och in vivo detektion av läkemedel, metaboliter, signalmolekyler, etc.
CID system, där två proteiner dimerize endast i närvaro av en liten molekyl ligand (figur 1), erbjuder mångsidiga verktyg för dissekera och manipulera metaboliska, signalering, och andra biologiska vägar1. De har visat potentialen i biologisk aktivering, såsom drogkontrollerad t-cell aktivering2 och apoptos3,4, för att förbättra säkerheten och effekten av adoptiv T cellterapi. Dessutom, de ger en ny metod för in vivo eller in vitro-detektion av små molekyler mål. Till exempel kan CID proteiner vara genetiskt smält med fluorescensreporter system (t. ex. fluorescens resonans energiöverföring (FRET)5 och cirkulärt perdämpad fluorescerande proteiner)6 för realtid in vivo mätningar, eller fungera som affinitetsreagens för Sandwich enzymkopplad immunosorbent assay (Elisa)-liknande analyser.
Trots sina breda tillämpningar, skapa nya CID-system som kan styras av en viss liten molekyl ligand har stora utmaningar. Etablerade protein bindemedel Engineering metoder inklusive Animal immunisering7, in vitro-val8,9, och Computational protein design10 kan generera ligand bindande proteiner som fungerar via binära protein-ligand interaktioner. Emellertid, dessa metoder har svårt att skapa en ligand-inducerad ternära CID Complex. Vissa metoder skapar CID genom att kemiskt länka två ligander som självständigt binder till samma eller olika proteiner11,12,13,14,15,16 eller förlita sig på att välja bindemedel proteiner som antikroppar riktar befintliga små molekyl-proteinkomplex17,18, och därmed har ett begränsat urval av ligander.
Vi har nyligen utvecklat en combinatorial binders-enabled sval av Cid (kombinerar-CID) metod för de Novo Engineering av CID system19. Denna metod kan erhålla den höga specificiteten av ligand-inducerad Dimerization (t. ex. en ankare-Dimerization binder dissociation konstant, Kd (utan ligand)/Kd (med ligand) > 1 000). Den Dimerization specificitet uppnås med hjälp av ankare bindemedel med flexibla bindningsställen som kan införa kon Formations förändringar på ligand bindning, vilket ger en grund för valet av överensstämningsmässigt selektiva bindemedel endast erkänna ligand-bundna ankare bindemedel. Vi demonstrerade ett proof-of-princip genom att skapa Cannabidiol (CBD)-inducerad heterodimerer av nanoorgan, en 12-15 kDa funktionella antikroppar fragment från camelid bestående av en universell ställningen och tre flexibla CDR slingor (figur 2)20, som kan bilda en bindande ficka med anpassningsbara storlekar för liten molekyl epitoper21,22. Framför allt bör in vitro-urvalet av ett kombinatoriskt protein bibliotek vara kostnadseffektivt och generaliserbart för CID-teknik eftersom samma högkvalitativa bibliotek kan appliceras på olika ligander.
I detta protokoll och video, fokuserar vi på att beskriva två steg in vitro-val och validering av ankare (figur 3A) och Dimerization bindemedel (figur 3B) genom att avskärma det kombinatoriska nanobody biblioteket med en mångfald som är högre än 109 med hjälp av CBD som mål, men protokollet bör tillämpas på andra protein bibliotek eller små molekyl mål. Screening av CID bindemedel tar vanligtvis 6 – 10 veckor (figur 4).
Det är viktigt att välja rätt koncentrationer av input phage bibliotek för olika omgångar av biopanning. Vi började vanligtvis från ett inmatnings bibliotek av ~ 1012-1013 fagpartiklar med en mångfald > 109, vilket gör ~ 100-1000 kopior av varje fagklon som skall presenteras i pull-down-analysen. Om fagkoncentrationen i ett bindnings test är för hög eller låg, kommer sannolikheten för icke-specifik bindning eller förlust av positiva kloner att öka. Valet av ankare eller Di…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av University of Washington Innovation Award (till L.G.), ett bidrag från US National Institutes of Health (1R35GM128918 till L.G.), och en startup fond vid University of Washington (till L.G.). H.J. stöddes av en Washington Research Foundation grundutbildning gemenskap. K.W. stöddes av en grundutbildning stipendium från University of Washington Institute for protein design.
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |