Fabbricazione di array di microelettrodi Ti3C2 MXene per la registrazione neurale In Vivo

Summary

Descriviamo qui un metodo per fabbricare array di microelettrodi Ti₃C₂ MXene e utilizzarli per la registrazione neurale in vivo.

Abstract

Le tecnologie impiantabili di microelettrodi sono state ampiamente utilizzate per chiarire le dinamiche neurali su microscala per ottenere una comprensione più profonda delle basi neurali delle malattie cerebrali e delle lesioni. Poiché gli elettrodi sono miniaturizzati alla scala delle singole cellule, un corrispondente aumento dell’impedimento dell’interfaccia limita la qualità dei segnali registrati. Inoltre, i materiali convenzionali degli elettrodi sono rigidi, con conseguente significativa disallineamento meccanico tra l’elettrodo e il tessuto cerebrale circostante, che suscita una risposta infiammatoria che alla fine porta a una degradazione delle prestazioni del dispositivo. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un processo per fabbricare microelettrodi flessibili basato su Ti₃C₂ MXene, un nanomateriale recentemente scoperto che possiede capacità volumetriche, conduttività elettrica, funzionalità superficiali e di processabilità notevolmente elevate. Gli array flessibili di microelettrodi Ti₃C₂ MXene hanno un notevole basso impedimento dovuto all’elevata conduttività e all’elevata superficie specifica delle pellicole Ti₃C₂ MXene, e hanno dimostrato di essere squisitamente sensibili per la registrazione dell’attività neuronale. In questo protocollo, descriviamo un nuovo metodo per micropatterning Ti₃C₂ MXene in array di microelettrodi su substrati polimerici flessibili e ne delineamo l’uso per la registrazione in vivo di microelettroblugrafia. Questo metodo può essere facilmente esteso per creare array di elettrodi MXene di dimensioni arbitrarie o geometria per una serie di altre applicazioni in bioelettronica e può anche essere adattato per l’uso con altri inchiostri conduttivi oltre a Ti₃C₂ MXene. Questo protocollo consente una fabbricazione semplice e scalabile di microelettrodi da inchiostri conduttivi basati su soluzione, e in particolare permette di sfruttare le proprietà uniche dell’idrofilo Ti₃C₂ MXene per superare molte delle barriere che hanno a lungo ostacolato la diffusa adozione di nanomateriali a base di carbonio per microelettrodi neurali ad alta fedeltà.

Introduction

Comprendere i meccanismi fondamentali alla base dei circuiti neurali e come le loro dinamiche sono alterate in malattie o lesioni, è un obiettivo fondamentale per sviluppare terapie efficaci per una vasta gamma di disturbi neurologici e neuromuscolari. Le tecnologie dei microelettrodi sono state ampiamente utilizzate per chiarire le dinamiche neurali su scale spaziali e temporali fini. Tuttavia, l’ottenimento di registrazioni stabili con elevato rapporto segnale-rumore (SNR) da elettrodi su microscala si è dimostrato particolarmente impegnativo. Poiché le dimensioni degli elettrodi sono ridotte per avvicinarsi alla scala cellulare, un corrispondente aumento degli elettrodi impedidegrada la qualità del segnale¹. Inoltre, numerosi studi hanno dimostrato che gli elettrodi rigidi composti da materiali elettronici convenzionali di silicio e metallici producono danni significativi e infiammazione nel tessuto neurale, che limita la loro utilità per la registrazione a lungo termine^2,3,4,5. Alla luce di questi fatti, c’è stato un notevole interesse nello sviluppo di microelettrodi con nuovi materiali che possono ridurre l’impedimento dell’interfaccia elettrode e possono essere incorporati in fattori di forma morbidi e flessibili.

Un metodo comunemente usato per ridurre l’impedimento dell’interfaccia del tessuto elettrodo è aumentare l’area su cui le specie ioniche nel fluido extracellulare possono interagire con l’elettrodo, o la “superficie effettiva” dell’elettrodo. Ciò può essere ottenuto attraverso la nanodorazione⁶, sgrossatura della superficie⁷, o elettroplastica con additivi porosi^8,9. I nanomateriali hanno guadagnato un’attenzione significativa in questo campo perché offrono superfici specifiche intrinsecamente elevate e combinazioni uniche di proprietà elettriche e meccaniche favorevoli¹⁰. Ad esempio, i nanotubi di carbonio sono stati utilizzati come rivestimento per ridurre significativamente l’impedimento degli elettrodi^11,12,13, l’ossido di grafene è stato trasformato in elettrodi morbidi e flessibili a sonda free-standing¹⁴, e il grafene poroso laser-pirolizzato è stato utilizzato per elettrodi flessibili e a basso impatto microbico (micro-ECoG)¹⁵. Nonostante la loro promessa, la mancanza di metodi di assemblaggio scalabili ha limitato l’adozione diffusa di nanomateriali per elettrodi di interfacciatura neurale. I nanomateriali a base di carbonio, in particolare, sono tipicamente idrofobici, e quindi richiedono l’uso di surfactants¹⁶, superacidi¹⁷, o la funzionalizzazione della superficie¹⁸ per formare acquisive dispersioni per metodi di lavorazione della soluzione, mentre metodi alternativi di fabbricazione, come la deposizione di vapore chimico (CVD), in genere richiedono alte temperature che sono incompatibili con molti substrati polimerici^{19,20,21 ,22}.

Recentemente, è stata descritta una classe di nanomateriali bidimensionali (2D), noti come MXenes, che offre un’eccezionale combinazione di alta conduttività, flessibilità, capacità volumetrica e idrofilia intrinseca, il che li rende una classe promettente di nanomateriali per elettrodi di interfacciatura neurale²³. Gli MXenes sono una famiglia di carburi metallici di transizione 2D e nitrati che sono più comunemente prodotti incidendo selettivamente l’elemento A da precursori stratificati. Queste sono tipicamente fasi MAX con la formula generale M_{n, 1}AX_n, dove M è un metallo di transizione precoce, A è un elemento del gruppo 12-16 della tabella periodica, X è carbonio e/o azoto e n – 1, 2 o 3²⁴. I fiocchi bidimensionali di MXene hanno gruppi funzionali che terminano la superficie che possono includere idrossile (OH), ossigeno o fluoro. Questi gruppi funzionali rendono MXenes intrinsecamente idrofila e consentono la modifica o la funzionalizzazione flessibile della superficie. Della grande classe di MXenes, Ti₃C₂ è stato il più ampiamente studiato e caratterizzato^25,26,27. Ti₃C₂ mostra capacità volumetrici notevolmente più elevata (1.500 F/cm³)^{28 rispetto} al grafene attivato (-60-100 F/cm³)²⁹, carbonio derivato da carbide (180 F/cm³)³⁰e pellicole di gel di grafene (260 F/cm³)³¹. Inoltre, Ti₃C₂ mostra un’elevata conduttività elettronica (10.000 S/cm)³², e la sua biocompatibilità è stata dimostrata in diversi studi^33,34,35,36. L’elevata capacità volumetrica dei film Ti₃C₂ è vantaggiosa per le applicazioni di rilevamento e stimolazione biologica, perché gli elettrodi che presentano un trasferimento di carica capacitivo possono evitare reazioni di idrolisi potenzialmente dannose.

Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato array di microelettrodi Ti₃C₂ flessibili e a film sottile, preparati utilizzando metodi di elaborazione delle soluzioni, in grado di registrare sia microelettrografia (microelettrocografica) che attività intracorticale di chiodare neuronale in vivo con alta SNR³⁶. Questi elettrodi MXene hanno mostrato un’impedibilità significativamente ridotta rispetto agli elettrodi in oro abbinato alle dimensioni (Au), che possono essere attribuiti all’elevata conduttività di MXene e all’alta superficie degli elettrodi. In questo protocollo, descriviamo i passaggi chiave per la fabbricazione di array di microelettrodi planari di Ti₃C₂ MXene su substrati parilini-C flessibili e loro utilizzandoli in vivo per la registrazione intraoperatoria micro-ECoG. Questo metodo sfrutta la natura idrofila di MXene, che rende possibile l’uso di metodi di lavorazione della soluzione che sono semplici e scalabili senza richiedere l’uso di surfactants o superacidi per ottenere sospensioni acquose stabili. Questa facilità di processo può consentire una produzione conveniente di biosensori MXene su scala industriale, che è stata una grave limitazione all’adozione diffusa di dispositivi basati su altri nanomateriali di carbonio. L’innovazione chiave nella fabbricazione degli elettrodi sta nell’uso di uno strato polimerico sacrificale per micromodello il MXene dopo il rivestimento a rotazione, un metodo adattato dalla letteratura sul poli trasformato in soluzione (3,4-ethylenedioxythiophene):poly (s tyrene sulfominato) microelettrodi³⁷, ma che non era stato precedentemente descritto per il modello MXene. Le eccezionali proprietà elettriche di Ti₃C_2,unite alla sua lavorabilità e alla morfologia 2D lo rendono un materiale molto promettente per le interfacce neurali. In particolare, Ti₃C₂ offre un percorso per superare il fondamentale compromesso tra l’area geometrica degli elettrodi e l’impedimento dell’interfaccia elettrochimica, un fattore limitante primario per le prestazioni degli elettrodi in microscala. Inoltre, la procedura di fabbricazione descritta in questo protocollo può essere adattata per produrre array di elettrodi MXene di diverse dimensioni e geometrie per diversi paradigmi di registrazione e può anche essere facilmente adattata per incorporare altri inchiostri conduttivi oltre a MXene.

Protocol

Tutte le procedure in vivo sono conformi alla Guida dei National Institutes of Health (NIH) per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università della Pennsylvania. 1. Sintesi di Ti3C2 MXene NOTA: le procedure di reazione descritte in questa sezione sono destinate all’uso all’interno di un cofano di fumi chimico. I passaggi di lavaggio inclusi in…

Representative Results

I dati di esempio micro-ECoG registrati su una matrice di microelettrodi MXene sono illustrati nella Figura 5. Dopo l’applicazione dell’array di elettrodi sulla corteccia, chiari segnali fisiologici sono stati immediatamente evidenti sugli elettrodi di registrazione, con circa 1 mV segnali di ampiezza ECoG che appaiono su tutti gli elettrodi MXene. Gli spettri di potenza di questi segnali confermarono la presenza di due ritmi cerebrali comunemente osservati nei ratti sotto anestesia ketamina…

Discussion

La procedura di sintesi e delaminazione MXene descritta in questo protocollo (HF/HCl/LiCl) è stata costruita dall’approccio di incisione MILD che impiegava un mezzo di incisione LiF/HCl (in situ HF)²⁶. L’approccio MILD permette di devastare spontaneamente grandi_fiocchi di Ti₃C (diversi m di dimensione laterale) durante il lavaggio, una volta raggiunto il pH 5/6. Rispetto all’incisione con la sola HF, questo si traduce in materiale con una qualità superiore e migliori propri…

Materials

00-90 screw	McMaster-Carr	90910A630	Skull screw around which ground wire is wrapped
128ch stimulation/recording controller	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
175 mL polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	REF: 352076	Used for washing
18 position 0.5 mm pitch ZIF connector	Molex	505110-1892	Used to interface the flexible Parylene microelectrode array with the PCB adapter board.
18 position dual row male nano-miniature (.025"/.64mm) connector	Omnetics Connector Corporation	A79008-001	Used to interface the PCB adapter board to the recording headstage.
3ML Disposable Plastic Set Transfer Graduated Pipettes	Rienar	Rienar-3ML-20PCS	Used for transferring etchant or MXene solutions
50 mL polyproylene (PP) concial centrifuge tube	Falcon	REF: 352070	Used for washing and size selection
Al etchant Type A	Transene	060-0026000-QT	For removing Al etch mask layer after final Parylene-C etch.
Aluminum Powder, -325 Mesh, 99.5% (metals basis), particle size < 44 µm	Alfa Aesar	CAS: 7429-90-5	Used for MAX synthesis
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Design software for drawing photomasks. Free alternatives include DraftSight and LayoutEditor.
Buffered Oxide Etchant 6:1	JT Baker	1178-03	For removing SiO2 layer to expose MXene electrode contacts at the end of the fabrication procedure.
Buprenorphine SR	Wildlife Pharmaceuticals		Analgesia for rat surgery
Centrifuge	Hermle	Benchmark Z 446	Used for washing and size selection
Dexdomitor	Midwest Veterinary Supply	193.13250.3	Anesthesia for rat surgery
Drill burr	Fine Science Tools	19007-07	Burrs for drill
Electric drill	Foredom	K.1070	Micromotor drill for craniotomies
Electron beam evaporator	Kurt J. Lesker Company		Used to evaporate Ti, Au, and SiO2 during fabrication. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Ground wire	A-M Systems	781500	Bare silver wire
Headspace Vial, glass	Supelco	REF: 27298	Used for storing MXene solutions
Hydrochloric acid (12.1N)	Fisher Scientific	CAS: 7647-01-0	Corrosive; etchant material
Hydrofluoric Acid, (48-51% solution in H2O)	Acros	CAS: 7664-39-3	Etchant material
Jupiter II RIE system	March Plasma Systems Inc.		Planar RIE etching system used to etch the Parylene-C using O2 plasma. Most university clean rooms have a comparable planar RIE etching system.
Kapton standard polyimide tape, 1/4"	DuPont		Used to add thickness to the Au bonding pad region of the flexible Parylene microelectrode array for insertion into the ZIF connector.
Ketamine	Hospital of the Univ. of Penn.		Anesthesia for rat surgery
KLA P-7 Stylus Profilometer	KLA Corporation		Used the measure 2D profiles to confirm complete etching through the sacrificial parylene-C layer in step 2.4.2. Most university clean rooms have this or a comparable stylus profilometer tool.
Lithium chloride, 99% for analysis, anhydrous	Acros	CAS: 7447-41-8	Hygroscopic; delamination material
MA6 mask aligner	Karl Suss Microtec AG		Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Micro-90 cleaning solution	International Products Corporation	M-9050-12	Used as the anti-adhesive layer to enable removal of the sacrificial Parylene-C layer to pattern the MXene
NR71-3000p photoresist	Futurrex Inc.	NR71-3000p	Negative photoresist used to define Ti/Au traces and MXene patterns in the devices.
Ophthalmic ointment	Midwest Veterinary Supply	193.63200.3	To prevent corneal drying during surgery
Parylene deposition system	Specialty Coating Systems		Used to evaporate thin conformal films of Parylene-C
Parylene-C dimer	Specialty Coating Systems	980130-c-01lbe	Flexible polymer used as bottom and top passivating layers for the flexible MXene devices
Photomasks (chrome on soda lime glass)	University of Pennsylvania		Our photomasks were produced in the University clean room using a Heidelberg DWL66+ laser writer system, however several vendors manufacture photomasks from provided design files.
Povidone-iodine solution	Medline	MDS093901	To help prevent infection around scalp incision
Printed Circuit Board (PCB)	Advanced Circuits		Used to interface between the MXene electrode array and the measurement electronics such as the potentiostat and the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on the provided design files.
RD6 Developer	Futurrex Inc.	RD6 Developer	Used to develop NR71-3000p negative photoresist following UV exposure
Reference 600 potentiostat	Gamry Instruments		Used to measure the electrodes' impedance to assess quality of the devices
Remover PG	MicroChem Corp.	G050200	Used to remove NR71-3000p following metal deposition to perform lift-off patterning
RHS2000 Stim SPI interface cable	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
RHS2116 amplifier board	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
Si wafers	Wafer World	2885	Substrate for fabrication
Spin Coater	Cost Effective Equipment		For coating wafers with resists and applying the Micro-90 and MXene layers. Most university clean rooms have spin coaters.
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 902	For positioning the rat for neurosurgery
Teflon-coated magnetic stir bar	Corning	REF: 1233W95	Used to stir during etching and intercalation
Titanium carbide, 99.5% (metals basis), particle size ~2 µm	Alfa Aesar	CAS: 12070-08-5	Used for MAX synthesis
Titanium powder, -325 mesh, 99% (metals basis), particle size < 44µm	Alfa Aesar	CAS: 7440-32-6	Used for MAX synthesis
Ultrasonic bath sonicator	Reynolds Tech		For removing metal and photoresist particles during lift-off processes to pattern metals.
UV vis spectrophotometer	ThermoScientific	Evolution 201	Used to determine concentration and observe absorption peak
Zetasizer, Particle Size Analysis	Malvern Panalytical	Nano ZS	Used to determine particle lateral size distibution