A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.
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Artigo de método
Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial
Neste artigo
Resumo
Resumo
Organóides oferecem estruturas de tecidos tridimensionais auto-organizadas que recapitulam processos fisiológicos na conveniência de um prato. A glândula mamária murina é composta por dois compartimentos de células epiteliais distintos, servindo funções diferentes: o compartimento mioepitelal externo e contraído e o compartimento luminal interno e secreto. Aqui, descrevemos um método pelo qual as células que compõem esses compartimentos são isoladas e, em seguida, combinadas para investigar suas contribuições individuais de linhagem para morfogemeee e diferenciação da glândula mamária. O método é simples e eficiente e não requer tecnologias sofisticadas de separação, como a triagem celular ativada por fluorescência. Em vez disso, colhemos e digerimos enzimáticamente o tecido, sedeo o epitélio em pratos de cultura de tecido aderente e, em seguida, usamos a tripsinização diferencial para separar o mioepitelial das células luminais com ~90% de pureza. As células são então banhadas em uma matriz extracelular onde se organizam em organóides bicamadas tridimensionais (3D) que podem ser diferenciadas para produzir leite após 10 dias na cultura. Para testar os efeitos das mutações genéticas, as células podem ser colhidas de modelos de camundongos selvagens ou geneticamente modificados, ou podem ser geneticamente manipuladas antes da cultura 3D. Esta técnica pode ser usada para gerar organóides de mosaico que permitem a investigação da função genética especificamente no compartimento luminal ou mioepitelélico.
Introdução
A glândula mamária (MG) é uma estrutura epitelia tubular em forma de árvore embutida dentro de um estroma rico em adrócitos. O epitélio ductal bicamada compreende uma camada externa, basal de contratura, células mioepitelélicas (MioECs) e uma camada interna de células epiteliais luminais e secretas (LECs), circundando um lúmen central1. Durante a lactação quando os MyoECs externos se contraem para espremer leite dos LECs alveolares internos, o MG sofre inúmeras alterações que estão o controle de fatores de crescimento (por exemplo, EGF e FGF) e hormônios (por exemplo, progesterona, insulina e prolactina). Essas alterações causam a diferenciação....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Santa Cruz.
1. Dia 1: Digestão da glândula mamária
- Prepare-se para colher os GMs de camundongos maduros de 10 a 14 semanas de idade.
- Realize a colheita em um banco aberto condições assépticas.
- Esterilize todos os suprimentos cirúrgicos, placas de cortiça e pinos por autoclaving e imersão em 70% de álcool por 20 min antes da cirurgia.
- Anestesiar animais com pentobarbital de sódio (dose anestéstica 2X de 0,06 mg/g de peso corporal) entregue através de injeção intr....
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Resultados
O protocolo aqui apresentado descreve um método para investigar contribuições específicas de linhagem de células epiteliais mamárias, fazendo uso de organóides de mosaico. Para obter células murinas primárias para organóides, o epitélio da glândula mamária deve primeiro ser isolado do estroma rico em adifrócito circundante(Figura 1). Este processo é descrito brevemente aqui e também é descrito em um estudo publicado anteriormente18. Pa.......
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Discussão
Aqui, um método é apresentado detalhando como os pesquisadores podem gerar culturas organóides 3D usando células MG primárias. A diferença entre este e outros protocolos é que detalhamos um método para separar os dois compartimentos de células MG distintos: os MyoECs basais externos e lecs internos. Nosso método emprega uma trypsin-EDTA de duas etapas (0,05%) tratamento que chamamos de trippsinização diferencial19. Este procedimento permite que os pesquisadores isolem MyoECs e LECs sem usar citome.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Ben Abrams pela assistência técnica e apoio do Instituto de Biologia de Células-Tronco da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC). Agradecemos a Susan Strome e Bill Saxton pelo uso de seu Microscópio Confocal do Disco Giratório Solamere. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios à UCSC do Howard Hughes Medical Institute através do James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), do NIH (NIH GM058903) para a iniciativa de maximizar o desenvolvimento estudantil (H.M.) e de a Fundação Nacional de Ciência para uma bolsa de pós-graduação em pesquisa (O.C. DGE 1339067) e por uma bolsa (A18-0370) do Comitê Coordenador de Pesquisa de ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo cônico de polipropileno de alta clareza de 15 ml (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| placa de fixação ultrabaixa de 24 poços (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| Prato de cultura de células de estilo fácil de segurar tratado com TC de 35 mm (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| tubo cônico de polipropileno de alta clareza de 50 ml (BD Falcon) | Fisher Scientific | ||
| Prato de Cultura de Células de Fácil Aderência de 60 mm tratado com TC (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µ Filtro de células de nylon M (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep também funciona |
| suplemento B27 sem vitamina A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP | camundongos The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Seringa de insulina 0,5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Classe 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Classe 3 Colagenase | Worthington Bioquímica | LS004206 | |
| Solução de Recuperação de Células Corning | Fisher Scientific | 354253 | Siga as diretrizes de uso – Extração de Estruturas Tridimensionais da Matriz Corning Matrigel Corning |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 poços | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexametasona | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, sem vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Desoxirribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Burro anti-cabra 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Uso a 1:500, Lote: 1608641, estoque 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Burro anti-rato 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Uso a 1:1000, Lote: 140554, estoque 1,4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered salina (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Sem Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Soro Fetal Bovino | VWR | 97068– 085 | 100% Origem dos EUA, grau premium, Lote: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referido como mídia de montagem no texto |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use em 1:250, Lote: J1011, estoque 200 µ g/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, estoque é 20mM |
| Insulina | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14– CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG); Sem Fenol Vermelho; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lote: 8204010, concentração de estoque 8.9 mg/mL |
| Unidade de Filtro MillexGV 0.22 µ m | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE Vidro de 8 poços, estéril | Millipore Sigma | PEZGS0816 | Estas corrediças de câmara são ótimas para remoção de juntas, mas outras marcas podem funcionar bem (por exemplo, Lab Tek II). |
| Uso de camundongo anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | a 1:500, Lote: 128M4881V, estoque 5,2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| Suplemento N-2 (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R& D | 5898-NR-050 | |
| Nacional de Hormona e Peptídeos | Profissura Ovina Hipofisária | Comprado do Dr. Parlow no Instituto de Pesquisa e Educação Harbor-UCLA | |
| Paraformaldaído | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | O Laboratório Jackson | 6148 | |
| Inibidor de Rho Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Hidróxido de Sódio | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soro de Burro Filtrado Estéril | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Soro de Burro Filtrado Estéril | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | |
| Tripsina EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referências
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr
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Reimpressões e permissões
