Fluorescerande märkta antibiotika är kraftfulla verktyg som kan användas för att studera flera aspekter av antimikrobiell resistens. Denna artikel beskriver beredningen av fluorescerande taggade antibiotika och deras tillämpning på att studera antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan användas för att studera mekanismer för bakteriell resistens (t.ex. efflux) genom spektrophotometri, flödescytometri och mikroskopi.
Fluorescerande antibiotika är mångsidiga forskningsverktyg som lätt används för studier av antimikrobiell resistens, på grund av deras betydande fördel jämfört med andra metoder. För att förbereda dessa sonder syntetiseras azidderivat av antibiotika, sedan tillsammans med alkyne-fluorofforer med azidalkyne dipolär cykloaddition genom klickkemi. Efter rening testas fluorescerande antibiotikas antibiotikas antibiotikas antibiotiska aktivitet genom minsta analys av hämmande koncentration. För att studera bakteriell ackumulering kan antingen spektrofotometri eller flödescytometri användas, vilket möjliggör mycket enklare analys än metoder som förlitar sig på radioaktiva antibiotikaderivat. Dessutom kan konfokal mikroskopi användas för att undersöka lokalisering inom bakterierna, vilket ger värdefull information om verkningssätt och förändringar som sker i resistenta arter. Användningen av fluorescerande antibiotikasonder i studien av antimikrobiell resistens är en kraftfull metod med stor potential för framtida expansion.
Antimikrobiell resistens (AMR) är en stigande kris som utgör ett stort hot mot människors hälsa runt om i världen. Resistens mot de flesta antibiotika har rapporterats, och infektioner orsakade av bakterier som är resistenta mot alla kliniskt tillgängliga läkemedel växer fram. För att bekämpa uppkomsten av amr måste vi öka vår förståelse av detta mångfacetterade fenomen och de underliggande mekanismerna och interaktionerna mellan antibiotika och bakterier. En aspekt som historiskt dåligt har förstått är permeationen av antibiotika till bakterier, tillsammans med fenomenen av ackumulering och efflux. Denna kunskap är avgörande för att utforma nya läkemedel och förståelse mekanismer för resistens. Detta spelar därför en avgörande roll i AMR-forskningen.
Det finns två huvudsakliga metoder som kan vidtas för att mäta antibiotikakoncentration: mätning av läkemedlet direkt eller märkning med en moiety som syftar till att underlätta kvantifiering. Även om märkning av antibiotika förbättrar upptäckt, kan detta störa den biologiska aktiviteten hos läkemedlet, såsom antimikrobiell aktivitet och permeabilitet. Detta är inte ett problem för otaggade metoder; detektion kan dock vara utmanande. Under de senaste åren har tekniska framsteg lett till en boom i forskning som använder massa pektrometri (MS) för att direkt mäta antibiotikakoncentrationen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Dessa studier har visat att det är möjligt att studera intracellulär ackumulering i en mängd olika bakterier, med gramnegativa bakterier som de mest studerade. Kvantifiering av molekylpermeabilitet har sedan kopplats till aktivitet och används för att informera läkemedelsutveckling2,3,4, men försiktighet måste iakttas när direkt sammanfallande ackumulering och målaktivitet5. Före ms utveckling, den enda antibiotika vars koncentration kunde mätas direkt var de som har inneboende fluorescens, såsom tetracyklin och kinoloner8,9,10,11. Även om det uppenbarligen begränsades i omfattning undersöktes och kvantifierades ackumulering och kvantifierades, vilket illustrerar nyttan av fluorescensbaserad kvantifiering.
Taggade antibiotika har använts i många decennier för att studera distributioner, handlingssätt och resistens, med radioaktiva och fluorescerande taggar är vanligt. Radiotaggade sonder har fördelen av att vara nästan identiska med den överordnade föreningen, därav den biologiska aktiviteten är osannolikt att vara betydligt annorlunda. Isotoper som 3H, 14C och 15N har ofta använts på grund av framträdandet av dessa element i antibiotika, och en mängd olika antibiotika byggnadsställningar har undersökts1,10,12,13. Även om detektion av radiosonder är enkel, finns det ett antal logistiska problem (t.ex. säkerhet, isotop halveringstid) som har begränsat användningen av detta tillvägagångssätt. En annan strategi är fluorescerande taggade antibiotika. Dessa sonder kan användas för att undersöka spridning och handlingssätt och resistens hos det överordnade läkemedlet, med hjälp av enklare teknik än MS och utan logistiska problem med strålning8. Den största nackdelen med detta tillvägagångssätt är att antibiotika är i allmänhet relativt små molekyler, därav införandet av en fluorescerande moiety utgör en betydande kemisk förändring. Denna förändring kan påverka fysiokemiska egenskaper och antibakteriell aktivitet. Därför måste man se till att bedöma dessa faktorer för att generera resultat som är representativa för moderantibiotikan.
I detta arbete beskrivs en metod för att syntetisera, bedöma och använda fluorescerande antibiotika, som i våra tidigare publikationer14,15,16. Genom tidigare arbete har ett antal fluorescerande antibiotika förberetts och använts för en mängd olika ändamål (se Sten m.fl.8). För att minimera sannolikheten för att påverka biologisk aktivitet används mycket små fluorofforer i detta arbete: nitrobenzoxadiazole (NBD, grön)och 7-(dimetylamino)-2-oxo-2 H-krom-4-yl (DMACA, blå). Vidare beskrivs bedömningen av antibakteriell aktivitet med hjälp av den lägsta mikrobrotsutspädningskoncentrationen (MIC), så att effekten av ändringar på aktiviteten kan mätas. Dessa fluorescerande taggade sonder kan användas i spektrofotometriska analyser, flödecytometri och mikroskopi. Utbudet av möjliga tillämpningar är där fördelen med fluorescerande antibiotika ligger. Cellulär ackumulering kan kvantifieras, kategoriseras och visualiseras, något som inte är möjligt med hjälp av MS ensam. Förhoppningen är att den kunskap som erhållits genom användning av fluorescerande antibiotika kommer att bidra till vår förståelse av resistens, och kampen mot AMR.
Skapandet av en framgångsrik fluorescerande antibiotikasond måste börja med noggrann planering och behandling av SAR av moderbolaget drogen. Om sar inte är känt eller helt utforskat kan flera alternativ behöva testas för att hitta en plats som kan ändras selektivt utan att den biologiska aktiviteten avskaffas. När en plats/s har identifierats är installationen av en linker moiety ofta nödvändig för att ge trappavstånd mellan det biologiska verkningsstället och den inaktiva fluorofforten. Man måste vara noga med att den reaktion som används för att fästa länkern på antibiotikan lämnar en biostabil funktionell grupp, och undviker till exempel estester som är mottagliga för klyvning av esteras in vivo. Beroende på antibiotikans farmakodynamiska och farmakokinetiska profil kan en enkel alkyllänkare användas, annars bör ett mindre lipofiliskt alternativ som en polyetenglykol (PEG) övervägas. Med länkaren bifogad, den antibakteriella aktiviteten bör bedömas för att säkerställa att MIC mot relevanta bakterier liknar modersubstansen.
I detta arbete rekommenderar vi användning av Huigsen azide-alkyne [3 +2] dipolär cycloaddition (klicka kemi, se figur 1)för att bli sänd fluoroffor till antibiotika, av flera skäl. Klickreaktioner är mycket selektiva, vilket innebär att skydd av reaktiva grupper på antibiotika inte är nödvändigt, och vidare lämnar reaktionen en stabil, biokompatibel triazolmoiety. Azidkomponenten introduceras till antibiotikumdelen i våra ingrepp, eftersom detta i allmänhet är lättare att åstadkomma med en mängd olika strukturella typer än införandet av en alkyne. Syntheses av två alkyne-härledda fluorofforer beskrivs här, även om andra kan utforskas om så önskas. NBD och DMACA valdes på grund av sin ringa storlek, vilket minimerar möjligheten att störa cellpenetration och målinteraktion. Klickreaktionen i sig utförs med kopparkatalys, där antingen Cu2+ (CuSO4, med ett askorbinsyrareducerande medel) eller Cu+ (CuI) kan användas som startreagens. Efter rening(figur 2)bör de minst utvecklade länderna testas som med aziden. Även med noggrann hänsyn till fluorofforval och fastsättningsställe är det möjligt att dålig antibiotikaaktivitet kommer att observeras. Detta innebär dock inte att en inaktiv sond är utan användning. Som visas med TMP sonder, föreningar med dålig antibakteriell aktivitet kan fortfarande binda till samma mål som förälder narkotikamissbruk. Detta kan möjliggöra studier om verkningssätt och undersökning av fenomen som leder till resistens, såsom efflux.
Som beskrivs i protokollavsnittet är det möjligt att analysera bakteriell märkning av fluorescerande antibiotika med antingen en enkel spektrofotometrianalys (figur 3) eller flödescytometri (figur 4). Båda metoderna kan kvantifiera cellulär ackumulering, och genom lysning celler och undersöka fluorescens lokalisering i lysate, är det möjligt att bedöma intracellulär ackumulering. I detta protokoll beskrivs användningen av lysozyme för celllys, eftersom detta är en snabb, universell teknik. Andra lysis villkor, såsom övernattning behandling med glycine-HCl7, har också framgångsrikt använts. Med hjälp av denna teknik är det möjligt att studera effekten av efflux på antibiotikacellulär ackumulering, vilket är en viktig resistensmekanism. Om efflux verkligen finns i bakterierna, en brist på intracellulära ackumulering kommer att observeras, även om detta kan räddas med hjälp av en efflux hämmare som CCCP.
Mikroskopi kan också utföras för att visuellt inspektera sondlokalisering i olika bakterier, samla information om verkningssätt, och eventuellt också motstånd (se figur 5 för representativa exempel). För att se lokalisering inom bakterier krävs ett högupplöstkonfokalmikroskop, utrustat med funktioner som SIM (strukturerad belysningsmikroskop), SR-SIM (superresolution-SIM), Luftyscan eller STED (stimulerad utarmning av utsläpp). Dessutom bör högpresterande följeskydd användas, och analys efter avbildning som utförs på en lämplig programvara (t.ex. FIJI, Zen eller Imaris). Lokalisering av sonder jämförs med färgämnen som färgar specifika arkitekturer, såsom Hoechst-33342 (blå, nukleinsyra), Syto-9 (grön, nukleinsyra) och FM4-64FX (röd, membran). Valet av färgämnen bör göras för att matcha fluorescerande antibiotika, så att varje färg som används har minimal spektral överlappning. För att få bästa möjliga bilder kan optimering krävas. Till exempel, om bakterier är för trångt på bilden, ta bara del av den suspenderade pelleten, späd sedan med mer montering medium. Däremot, om bakterier är för glesa på bilden, helt enkelt börja med fler bakterier. I detta protokoll rekommenderas användning av en termoreversibel gel som är kompatibel med levande celler (t.ex. Cygel) för levande cellavbildning, eftersom den immobiliserar bakterier (inklusive rörliga bakterier), men andra monteringsmedier eller agarose har också använts framgångsrikt.
Sammantaget, trots utmaningar som kan ställas inför vid utarbetandet av en biologiskt aktiv fluorescerande antibiotikaderivat, enkelheten i deras användning och deras mångsidighet gör dessa sonder attraktiva verktyg för forskning inom AMR. Framtida arbete med fluorescerande antibiotika har potential att ge insikt i mekanismer för antibiotikaresistens, förbättra vår förståelse för hur nuvarande antibiotika fungerar och bidra till utvecklingen av bättre läkemedel.
The authors have nothing to disclose.
MRLS stöds av australian GraduateGraduate Award (APA) och ett Institut för molekylär biovetenskap Research Advancement Award. Wanida Phetsang stöddes av UQ International Scholarship (UQI) och IMB GraduateGraduate Award (IMBPA). MAC är en NHMRC princip forskarassistent (APP1059354) och har också en fraktionerad professorsforskar stipendiat utnämning vid University of Queensland, med sin återstående tid som VD för Inflazome Ltd, ett företag som utvecklar läkemedel för att ta itu med kliniska otillfredsställda behov i inflammatorisk sjukdom. MATB stöds delvis av Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z och NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi utfördes vid Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som inrättades med stöd av ACRF.
3-(dimethylamino)phenol | Alfa-Aesar | B23067 | |
4-chloro-7-nitro-benzofuran | Sigma-Aldrich | 163260-5G | |
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane | Merck | UFC501096 | |
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10×250 mm) | Waters | 186008205 | |
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) | Waters | 186003734 | |
Bruker Avance 600 MHz spectrometer | Bruker | ||
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge | Buchi | BUC145152103 | |
CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
Celite 545 | Sigma-Aldrich | 22140-5KG-F | |
Cygel | ABCAM | Ab109204 | |
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope | Zeiss | ||
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain | Life Technologies Australia Pt | F34653 | |
Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise | CHRIST | ||
Gilson HPLC 2020 | Gilson | ||
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 | Hettich | ||
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) | Schott/Zeiss | 474030-9000-000 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – Fluo | Life Technologies Australia Pt | H21492 | |
LB | AMRESCO | J106 | |
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation | Leica | ||
Lysozyme from chicken egg white lyophilized powder |
Sigma-Aldrich | L6876 | |
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted | Becton Dickinson | 212322 | |
Propargylamine | Sigma-Aldrich | P50900-5G | |
Reveleris GRACE MPLC | Buchi | ||
Shimadzu LCMS-2020 | Shimadzu | ||
Sigma 1-15 Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | ||
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) | Merck | 1093859025 | |
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Life Technologies Australia Pt | S34854 | |
TECAN Infinite M1000 PRO | TECAN |