헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화
Summary
이 작품은 적절한 노출 방법에서 배아 처리 및 에탄올 분석에 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피쉬 배아에서 에탄올 수준을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
태아 알콜 스펙트럼 무질서 (FASD)는 안면 이형성증 및 신경 손상을 포함하여 에탄올 유도한 발달 결함의 높게 변명한 연속체를 기술합니다. 복잡한 병리학으로, FASD는 미국에서 태어난 100명의 아이들에 대하여 대략 1에 매년 영향을 미칩니다. FASD의 매우 가변적인 특성으로 인해 동물 모델은 에탄올로 인한 개발 결함에 대한 현재의 기계적 이해에서 중요한 것으로 입증되었습니다. 점점 더 많은 실험실에서 제브라피시를 사용하여 에탄올로 인한 발달 결함을 검사하는 데 주력하고 있습니다. Zebrafish는 외부에서 수정되고 유전적으로 견인할 수 있는 반투명 배아를 다수 생산합니다. 이를 통해 연구자들은 여러 유전적 맥락에서 에탄올 노출의 타이밍과 복용량을 정확하게 제어하고 라이브 이미징 기술을 통해 배아 에탄올 노출의 영향을 정량화할 수 있습니다. 이것은 유전학과 인간과의 발달의 높은 수준의 보존과 결합되어, 에탄올 기형의 기계적 기초를 연구하는 강력한 모델로 제브라피쉬가 입증되었습니다. 그러나, 에탄올 노출 식이요법은 이 연구 결과에 걸쳐 제브라피시 데이터의 해석을 혼동한 다른 제브라피시 연구 사이에서 변화했습니다. 여기서는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피시 배아에서 에탄올 농도를 정량화하는 프로토콜이다.
Introduction
태아 알코올 스펙트럼 장애(FASD)는 배아 에탄올 노출과 관련된 광범위한 신경 장애 및 두개안면이상학을1. 에탄올 노출 및 유전적 배경의 타이밍 및 투여량을 포함한 여러 요인이 FASD2,3의변이에 기여한다. 인간에서는, 이 변수의 복잡한 관계는 공부하고 FASD의 병인학을 이해하는 도전을 만듭니다. 동물 모델은 에탄올 기형의 기계적 기초에 대한 우리의 이해를 개발하는 데 중요한 것으로 입증되었습니다. 다양한 동물 모델 시스템이 FASD의 여러 측면을 연구하는 데 사용되었으며 결과는 인간에서 노출에서 발견되는 것과 현저하게 일치했습니다4. 설치류 모델 시스템은 FASD의 많은 측면을 검사하는 데 사용되며 마우스가 가장 일반적인5,6,7입니다. 이 작업의 대부분은 초기 에탄올 노출에 발달 결함에 초점을 맞추고있다8,에탄올에 나중에 노출뿐만 아니라 개발 이상을 일으키는 것으로 나타났다하지만9. 더욱이, 마우스의 유전 적 능력은 FASD10,11의유전 적 기초를 탐구하는 우리의 능력에 크게 도움이되었습니다. 마우스에서 이러한 연구는 강하게 소닉 고슴도치 경로와 유전자 에탄올 상호 작용이 있음을 제안, 레티노산 신호, 수퍼 옥사이드 디스뮤타아제, 산화 산화 신타제 I, Aldh2 및 Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. 이러한 연구는 동물 모델이 FASD와 그 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요하다는 것을 보여줍니다.
제브라피쉬는 에탄올 기형의 여러 측면을 검사하는 강력한 모델 시스템으로 부상하고있다 22,23. 그들의 외부 풍부하게 함, 높은 fecundity, 유전 성 및 살아있는 화상 진찰 기능 때문에, zebrafish는 이상적으로 에탄올 기형의 타이밍, 복용량 및 유전학과 같은 요인을 공부하기 위하여 적당합니다. 에탄올은 정확하게 단계적 배아에 투여될 수 있고 배아는 발달 과정 동안 에탄올의 직접적인 영향을 조사하기 위해 이미지화될 수 있다. 이 연구는 개발의 유전 프로그램이 제브라피시와 인간 사이에서 매우 보존되어 있기 때문에 인간과 직접 관련될 수 있으며 따라서 FASD 인간 연구24를안내하는 데 도움이 될 수 있다. 제브라피쉬가 에탄올 기형 생성을 검사하는 데 사용되었지만, 배아 에탄올 농도보고에 대한 합의가 부족하면 인간과 비교하기가 어렵다25. 포유류 시스템에서, 혈중 알코올 수준은 조직 에탄올 수준과 직접 상관 관계26. 제브라피쉬 연구의 대부분은 순환계가 완전히 형성되기 전에 배아를 치료합니다. 검사할 모계 샘플이 없는 경우, 에탄올 농도를 평가하는 과정이 배아 내의 에탄올 수준을 정량화하는 데 필요합니다. 여기에서 우리는 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 개발 하는 제브라피시 배아에서 에탄올 농도를 정량화하는 과정을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
개발 모델 시스템인 zebrafish는 환경 요인이 개발에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다. 그(것)들은 에탄올 연구 결과에 있는 정확한 타이밍 그리고 복용량 패러다임을 허용하는 외부기름지게 한 태아의 다수를 일으킵니다. 이것은 살아있는 화상 진찰 기능 및 인간을 가진 유전과 발달 보존과 결합하여, zebrafish를 기형학 연구를 위한 강력한 모형 체계를 만듭니다. 기재된 것은 헤드 스페이스 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 문서에 제시된 연구는 J.K.E에 국립 보건원/국립 치과 및 두개안면 연구 (NIH/NIDCR) R01DE020884에서 이전 교부금에 의해 지원되었습니다. 그리고 알코올 남용 및 알코올 중독에 대한 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 (NIH / NIAAA) F32AA021320 C.B.L.에 알코올 남용에 대한 국립 보건 원 / 국립 연구소의 현재 보조금에 의해 (NIH / NIAAA) R00AA023560 에 C.B.L. 우리는 가스 크로마토그래프 분석을 제공하고 지원해 준 Rueben Gonzales에게 감사드립니다. 티아나 온티베로스와 지나 노블스 박사의 글쓰기 지원에 감사드립니다.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
Referências
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
