Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung des Ethanolgehalts in einem Zebrafisch-Embryo mithilfe der Kopfraumgaschromatographie von geeigneten Expositionsmethoden für die Embryoverarbeitung und Ethanolanalyse.
Abstract
Fetale Alkoholspektrumsstörungen (FASD) beschreiben ein hochvariables Kontinuum von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern, einschließlich Gesichtsdysmorphologien und neurologischen Beeinträchtigungen. Bei einer komplexen Pathologie betrifft FASD etwa 1 von 100 Kindern, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten geboren werden. Aufgrund der sehr variablen Natur von FASD haben sich Tiermodelle in unserem aktuellen mechanistischen Verständnis von ethanolinduzierten Entwicklungsfehlern als kritisch erwiesen. Immer mehr Laboratorien konzentrieren sich auf die Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten, genetisch befruchtbaren, durchscheinenden Embryonen. Dies ermöglicht es Forschern, Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition in mehreren genetischen Kontexten präzise zu steuern und die Auswirkungen der embryonalen Ethanol-Exposition durch Live-Bildgebungstechniken zu quantifizieren. Zusammen mit dem hohen Grad an Erhaltung sowohl der Genetik als auch der Entwicklung beim Menschen hat sich der Zebrafisch als ein starkes Modell erwiesen, um die mechanistische Grundlage der Ethanol-Teratogenität zu untersuchen. Die Ethanolexpositionsschemas unterscheiden sich jedoch zwischen verschiedenen Zebrafischstudien, was die Interpretation von Zebrafischdaten in diesen Studien verwirrt hat. Hier ist ein Protokoll zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen mittels Kopfraumgaschromatographie.
Introduction
Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschreibt eine breite Palette von neurologischen Beeinträchtigungen und craniofacial Dysmorphologien im Zusammenhang mit embryonalen Ethanol-Exposition1. Mehrere Faktoren, einschließlich Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition und genetischen Hintergrund, tragen zur Variation von FASD2,3. Beim Menschen macht die komplexe Beziehung dieser Variablen das Studium und Verständnis der Ätiologie der FASD schwierig. Tiermodelle haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlage der Ethanol-Teratogenität erwiesen. Eine Vielzahl von Tiermodellsystemen wurde verwendet, um mehrere Aspekte der FASD zu untersuchen, und die Ergebnisse stimmten bemerkenswert mit dem überein, was bei der Exposition beim Menschen gefunden wird4. Nagetiermodellsysteme werden verwendet, um viele Aspekte von FASD zu untersuchen, wobei Mäuse die häufigsten5,6,7sind. Der Großteil dieser Arbeit konzentrierte sich auf Entwicklungsdefekte bei früher Ethanol-Exposition8, obwohl sich eine spätere Exposition gegenüber Ethanol als Entwicklungsanomalien sowie9erwiesen hat. Darüber hinaus haben die genetischen Fähigkeiten von Mäusen in unserer Fähigkeit, die genetischen Grundlagen von FASD10,11zu erforschen, stark unterstützt. Diese Studien an Mäusen deuten stark darauf hin, dass es Gen-Ethanol-Wechselwirkungen mit dem Schall-Igel-Signalweg, Retinsäure-Signalisierung, Superoxid-Dismutase, Stickoxid-Synthase I, Aldh2 und Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19,20,21. Diese Studien zeigen, dass Tiermodelle entscheidend sind, um unser Verständnis von FASD und seinen zugrunde liegenden Mechanismen zu fördern.
Der Zebrafisch hat sich als ein leistungsfähiges Modellsystem entwickelt, um viele Aspekte der Ethanolteratogenese22,23zu untersuchen. Aufgrund ihrer externen Befruchtung, hohen Fruchtbarkeit, genetischen Traktionsfähigkeit und Live-Bildgebung sind Zebrafische ideal geeignet, um Faktoren wie Timing, Dosierung und Genetik der Ethanol-Teratogenese zu untersuchen. Ethanol kann präzise inszenierten Embryonen verabreicht werden und die Embryonen können dann abgebildet werden, um die direkte Wirkung von Ethanol während der Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Diese Arbeit kann direkt mit dem Menschen in Verbindung gebracht werden, da die genetischen Entwicklungsprogramme zwischen Zebrafischen und Menschen stark konserviert sind und daher helfen können, FASD-Humanstudien zu leiten24. Während Zebrafische verwendet wurden, um Ethanol-Teratogenese zu untersuchen, macht ein Mangel an Konsens bei der Meldung embryonaler Ethanolkonzentrationen den Vergleich mit Menschen schwierig25. In Säugetiersystemen korrelieren Blutalkoholwerte direkt mit dem Ethanolspiegel des Gewebes26. Viele der Zebrafisch-Studien behandeln Embryonen vor der vollständigen Bildung ihres Kreislaufsystems. Da keine mütterliche Probe zu untersuchen ist, ist ein Verfahren zur Bewertung der Ethanolkonzentrationen erforderlich, um den Ethanolgehalt im Embryo zu quantifizieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in einem sich entwickelnden Zebrafisch-Embryo mittels Kopfraumgaschromatographie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als Entwicklungsmodellsystem sind Zebrafische ideal geeignet, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Entwicklung zu untersuchen. Sie produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, was präzise Timing- und Dosierungsparadigmen in Ethanolstudien ermöglicht. Zusammen mit den Live-Bildgebungsfunktionen und der genetischen und Entwicklungserhaltung mit Menschen machen Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellsystem für teratologische Studien. Described ist ein Protokoll zur Messung embryonaler…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch frühere Stipendien der National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 an J.K.E. unterstützt. und National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Wir danken Rueben Gonzales für die Bereitstellung und Unterstützung bei der Analyse von Gaschromatographen. Wir danken Tiahna Ontiveros und Dr. Gina Nobles beim Schreiben.
Materials
| Air | Provided by contract to the university | ||
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| AutoSampler, CP-8400 | Varian | Gas Chromatograph Autosampler | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa |
| Gas Chromatograph, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Provided by contract to the university | ||
| HP Innowax capillary column | Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick |
| Hyrdogen | Provided by contract to the university | ||
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap | Agilent | 5190-7021 | Replacement caps/septa for gas chromatograph vials |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Silica Beads .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Silica Beads 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane | Millipore Sigma | 57343-U | Replacement fibers |
| Star Chromatography Workstation | Varian | Chromatography software | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa | Millipore Sigma | 23154 | Replacement inlet septa |
Referências
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
- Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
- Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
- Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
- Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
- Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
- Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
- Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
- Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
- Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
- Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
- Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
- Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
- Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
- Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
- Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
- Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
- Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 248 (2), 307-318 (2002).
- Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
- Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
- Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
- Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
- Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
- Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
- Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
- Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
- Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
- Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).
