Este trabalho descreve um protocolo para quantificar os níveis de etanol em um embrião de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça de métodos de exposição adequados ao processamento de embriões e análise de etanol.
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Artigo de método
Quantificação dos níveis de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça
Neste artigo
Resumo
Resumo
Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem um contínuo altamente variável de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol, incluindo dismorfiologias faciais e prejuízos neurológicos. Com uma patologia complexa, a FASD afeta aproximadamente 1 em cada 100 crianças nascidas nos Estados Unidos a cada ano. Devido à natureza altamente variável da FASD, os modelos animais têm se mostrado críticos em nossa compreensão mecanicista atual de defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Um número crescente de laboratórios se concentrou no uso de zebrafish para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos por etanol. Os zebrafish produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, geneticamente tráteis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem precisamente o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em múltiplos contextos genéticos e quantifiquem o impacto da exposição embrionária do etanol por meio de técnicas de imagem ao vivo. Isso, combinado com o alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento com humanos, provou que os zebrafish são um modelo poderoso para estudar a base mecanicista da teratogenicidade do etanol. No entanto, os regimes de exposição ao etanol variaram entre diferentes estudos de zebrafish, o que confundiu a interpretação dos dados de zebrafish nesses estudos. Aqui está um protocolo para quantificar as concentrações de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça.
Introdução
Os Distúrbios do Espectro Alcoólica Fetal (FASD) descrevem uma ampla gama de deficiências neurológicas e dismorfimias craniofaciais associadas à exposição embrionária do etanol1. Múltiplos fatores, incluindo tempo e dosagem de exposição ao etanol e fundo genético, contribuem para a variação do FASD2,3. Em humanos, a complexa relação dessas variáveis torna o estudo e a compreensão da etiologia do FASD desafiador. Os modelos animais têm se mostrado cruciais no desenvolvimento da nossa compreensão da base mecanicista da teratogenicidade do etanol. Uma grande variedade de sistemas de modelo....
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Protocolo
Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram levantados e criados seguindo protocolos estabelecidos da IACUC27. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade do Texas em Austin e pela Universidade de Louisville.
NOTA: A linha de zebrafish Tg (fli1:EGFP)y1 foi utilizada neste estudo28. Toda a água utilizada neste procedimento é água de osmose reversa estéril. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Graphpad Prism v8.2.1.
1. Fazendo mídia embrionária
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Resultados
Os níveis de etanol sanguíneo não podem ser determinados em zebrafish embrionário siciado precocemente, porque eles não têm um sistema circulatório totalmente formado. Para determinar o nível de concentração de etanol nos embriões de zebrafish, os níveis de etanol são medidos diretamente a partir de tecido embrionário homogeneizado. Para medir adequadamente as concentrações embrionárias de etanol, o volume embrionário deve ser levado em conta. O embrião (gema anexada) fica dentro da corção (casca de ovo) cercada por flui.......
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Discussão
Como um sistema modelo de desenvolvimento, os zebrafish são idealmente adequados para estudar o impacto dos fatores ambientais no desenvolvimento. Eles produzem um grande número de embriões fertilizados externamente, o que permite paradigmas precisos de tempo e dosagem em estudos de etanol. Isso, combinado com as capacidades de imagem ao vivo e a conservação genética e de desenvolvimento com humanos, faz do zebrafish um poderoso sistema modelo para estudos de teratologia. Descrito é um protocolo para medir as concentraçõ.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por subvenções anteriores dos Institutos Nacionais de Saúde/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIH/NIDCR) R01DE0208884 para J.K.E. e InstitutoNacional de Saúde/Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo (NIH/NIAAA) F32AA021320 para C.B.L. e pela atual subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde/Instituto Nacional de Abuso de Álcool (NIH/NIAAA) R00AA023560 para C.B.L. Agradecemos a Rueben Gonzales por fornecer e ajudar na análise do cromatógrafo a gás. Agradecemos a Tiahna Ontiveros e à Dra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ar | fornecido por contrato com a universidade | ||
| Balança analítica | VWR | 10204-962 | |
| Amostrador automático, CP-8400 | Cromatógrafo a gás | Varian | |
| Cloreto de cálcio | VWR | 97062-590 | |
| Etanol | Decon Labs | 2701 | |
| Frasco para cromatógrafo gasoso com septo de politetrafluoretileno/silicone e tampa plástica 2 mL | Agilent | 8010-0198 | Pode reutilizar os frascos após a limpeza, mas não as tampas/septos |
| Cromatógrafo Gasoso, CP-3800 | Varian | ||
| Helium | Fornecido por contrato para a coluna | ||
| capilar HP Innowax | da universidade Agilent | 19095N-123I | 30 m x 0,53 mm x 1,0 μ m filme espesso |
| Hyrdogen | Fornecido por contrato para a universidade | ||
| Sulfato de Magnésio (Heptahidratado) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Tubo de microcentrífuga 1,5 mL | Fisher Scientific | 2682002 | |
| Micropipeta pontas 10 μ L | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Pontas de Micropipeta 1000 μ L | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Pontas de Micropipeta 200 μ L | Fisher Scientific | 13611112 | |
| placas de Petri 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Pipetman L p1000L Micropipeta | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipeta | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipeta | Gilson | FA10001M | |
| Politetrafluoretileno/silicone septo e tampa de plástico | Agilent | 5190-7021 | Tampas de substituição/septos para frascos de cromatógrafo gasoso |
| Cloreto de Potássio | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Fosfato de Potássio (Dibásico) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pronase | VWR | 97062-916 | |
| Contas de Sílica .5 mm | Biospec Products | 11079105z | |
| Contas de Sílica 1.0 mm | Biospec Products | 11079110z | |
| Bicarbonato de Sódio | VWR | BDH9280-500G | |
| Cloreto de Sódio | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Fosfato de Sódio (Dibásico) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Conjunto de fibra de microextração em fase sólida Carboxen/Polidimetilsiloxano | Millipore Sigma | 57343-U | Estação de trabalho de |
| cromatografia estrela | Software de cromatografia | Varian | |
| Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septos | Millipore Sigma | 23154 | Septos de entrada de substituição |
Referências
- Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
- Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology.....
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Reimpressões e permissões
