Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia
Summary
Presentamos un protocolo para inmovilizar macromoléculas individuales en dispositivos microfluídicos y cuantificar los cambios en sus conformaciones bajo el flujo de cizallamiento. Este protocolo es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas y funcionales de biomoléculas como proteínas y ADN en un entorno de flujo.
Abstract
El comportamiento de una sola molécula bajo perturbación mecánica se ha caracterizado ampliamente para entender muchos procesos biológicos. Sin embargo, métodos como la microscopía de fuerza atómica tienen una resolución temporal limitada, mientras que la transferencia de energía por resonancia de ferster (FRET) solo permite deducir las conformaciones. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, permite la visualización in situ en tiempo real de moléculas individuales en diversas condiciones de flujo. Nuestro protocolo describe los pasos para capturar los cambios de conformación de biomoléculas individuales en diferentes entornos de flujo de cizallamiento mediante microscopía de fluorescencia. El flujo de cizallamiento se crea dentro de canales microfluídicos y se controla mediante una bomba de jeringa. Como demostraciones del método, el factor von Willebrand (VWF) y el ADN lambda están etiquetados con biotina y fluoróforo y luego se inmovilizan en la superficie del canal. Sus conformaciones se monitorean continuamente bajo flujo de cizallamiento variable utilizando la reflexión interna total (TIRF) y la microscopía de fluorescencia confocal. La dinámica reversible de desenmaraña de VWF es útil para entender cómo su función está regulada en la sangre humana, mientras que la conformación del ADN lambda ofrece información sobre la biofísica de las macromoléculas. El protocolo también se puede aplicar ampliamente para estudiar el comportamiento de los polímeros, especialmente los biopolímeros, en diferentes condiciones de flujo e investigar la reología de fluidos complejos.
Introduction
Se han estudiado ampliamente los mecanismos de cómo las biomoléculas responden a los estímulos ambientales. En un entorno de flujo en particular, las fuerzas de cizallamiento y elongacional regulan los cambios de conformación y potencialmente la función de las biomoléculas. Ejemplos típicos incluyen el desenmarañamiento inducido por cizallamiento del ADN lambda y el factor von Willebrand (VWF). Lambda DNA se ha utilizado como herramienta para comprender la dinámica conformacional de las cadenas de polímeros individuales y flexibles y la reología de las soluciones poliméricas1,2,3,4. El VWF es un sensor de flujo natural que agrega plaquetas en los sitios de las heridas de los vasos sanguíneos con tasas de cizallamiento y patrones de flujo anormales. El desenmarañamiento de VWF es esencial para activar la unión de plaquetas al dominio A1 y la unión de colágeno al dominio A3. Además, el desdoblamiento del dominio A2 inducido por alto cizallamiento permite el escisión del VWF, que regula su distribución del peso molecular en la circulación5,6. Por lo tanto, la visualización directa de cómo estas moléculas se comportan bajo el flujo puede mejorar en gran medida nuestra comprensión fundamental de su biomecánica y función, lo que a su vez puede permitir nuevas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
Las metodologías típicas para caracterizar las conformaciones de una sola molécula incluyen pinzas ópticas/magnéticas, microscopía de fuerza atómica (AFM) y transferencia de energía de resonancia de una sola molécula (FRET)7. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula es una poderosa herramienta para investigar la fuerza y el movimiento asociados con los cambios de conformación de las biomoléculas. Sin embargo, carece de la capacidad de mapear las conformaciones moleculares generales8. AFM es capaz de crear imágenes con alta resolución espacial, pero está limitada en resolución temporal9,10. Además, el contacto entre la punta y la muestra puede confundir la respuesta inducida por el flujo. Otros métodos como el FRET y el análisis de nanoporos determinan los estados de plegado y despliegue de proteínas de una sola molécula en función de la detección de la distancia intramolecular y los volúmenes excluidos. Sin embargo, estos métodos todavía están en su infancia y limitados en su observación directa de las conformaciones de una sola molécula11,12,13,14.
Por otro lado, observar directamente macromoléculas con alta resolución temporal y espacial bajo microscopía de fluorescencia ha mejorado nuestra comprensión de la dinámica de una sola molécula en muchos procesos biológicos15,16. Por ejemplo, Fu y otros lograron recientemente la visualización simultánea del alargamiento VWF y la unión del receptor de plaquetas por primera vez. En su trabajo, las moléculas de VWF fueron inmovilizadas en la superficie de un canal microfluídico a través de interacciones biotina-estreptavidina e imágenes bajo microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) en diferentes ambientes de flujo de cizallamiento17. Aplicando un método similar al de Fu, aquí demostramos que las conformaciones de VWF y ADN lambda se pueden observar directamente bajo TIRF y microscopía de fluorescencia confocal. Como se muestra en la Figura 1,los dispositivos microfluídicos se utilizan para crear y controlar el flujo de cizallamiento, y las biomoléculas se inmovilizan en la superficie del canal. Tras la aplicación de diferentes tasas de cizallamiento, se registran conformaciones de la misma molécula para medir la longitud de la extensión, también se muestra en la Figura 1. El método podría aplicarse ampliamente para explorar otros comportamientos de polímeros en entornos de flujo complejos para estudios reológicos y biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obtener datos de alta calidad de cambios de conformación de una sola molécula utilizando la microscopía de fluorescencia como se describe en este método, es fundamental incubar la molécula durante el tiempo adecuado, minimizar sus interacciones inespecíficas con la superficie y establecer ajustes de microscopio que reduzcan el fotoblanqueo. La capacidad de la molécula para cambiar libremente la conformación está relacionada con el número de interacciones biotina-estreptavidina formadas entre la molécula y…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias DMS-1463234, los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL082808 y AI133634, y la financiación interna de la Universidad de Lehigh.
Materials
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
Referências
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