Подход, основанный на интравитальной микроскопии для оценки проницаемости кишечника и эпителиальной пролития клеток
Summary
Воспользовавшись интравитальной микроскопией, представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать пролитие кишечных эпителиальных клеток у живых животных. Поэтому местно окрашенные слизистые оболочки кишечника (акрифлавин и родаминБ-декстран) эстетизированных мышей изобразованы до одноклеточного разрешения с помощью конфокаленной микроскопии.
Abstract
Интравитальная микроскопия кишечника с помощью конфокальной визуализации позволяет в режиме реального времени осуществлять наблюдение за эпителиальным пролитием клеток и утечкой барьеров у живых животных. Таким образом, слизистая оболочка кишечника анестезированных мышей местно окрашены неспецифическим окрашивания (акрифлавин) и флуоресцентный трассировщик (родамин-B декстран), установленный на солевой раствор промыть пластины и непосредственно изображения с помощью конфокального микроскопа. Этот метод может дополнять другие неинвазивные методы для выявления утечки кишечной проницаемости, такие как трансмукозальный проход устно управляемых трассировщиков. Кроме того, представленный здесь подход позволяет осуществлять прямое наблюдение за событиями, которые проливают клетки в режиме реального времени. В сочетании с соответствующими флуоресцентными мышами-репортерами этот подход подходит для пролития света в клеточные и молекулярные механизмы, контролирующие экструзию кишечных эпителиальных клеток, а также на другие биологические процессы. В последние десятилетия, интересные исследования с использованием интравитальной микроскопии способствовали знания по эндотелиальной проницаемости, иммунной клетки кишечника самонаведения, иммунно-эпителиальной связи и вторжения светящихся компонентов, среди других. Вместе представленный здесь протокол не только поможет повысить понимание механизмов контроля экструзии эпителиальных клеток, но и может стать основой для развития других подходов, которые будут использоваться в качестве инструментов для визуализации других высокодинамитических клеточных процессов, даже в других тканях. Среди технических ограничений оптические свойства конкретной ткани, а также выбранная технология визуализации и конфигурация микроскопа, в свою очередь, определяют расстояние работы изображения и разрешение полученных изображений.
Introduction
Кишечник является высокоспециализированным органом с жестко регулируемой функцией, позволяющей конфликтующие процессы, а именно питание и защита от вредных светящихся веществ. Подкладка между человеческим телом и окружающей средой, кишечный эпителий действует как физический и иммунологический барьер и способствует поддержанию слизистой гомеостаза вкишечнике 1,2. Потеря эпителиальной целостности и повышенная проницаемость плотного соединения, как известно, связаны с воспалительными заболеваниями кишечника (IBD)3,,4,,5,,6. Эпителиальные изменения затем рассматриваются в качестве причин и вторичных усилителей для хронического воспаления кишечника в IBD. Таким образом, улучшение понимания ранних эпителиальных изменений в кишечнике пациентов IBD будет иметь огромное значение для разработки новых стратегий по восстановлению эпителиальной целостности для надежного прогнозирования и последующей профилактики рецидивов IBD.
Кишечный эпителий следует за сложным и жестко регулируемым процессом оборота. Из склепа дно, неизлечимо дифференцированных кишечных эпителиальных клеток (IECs), полученных из плюрипотентных стволовых клеток мигрируют вверх к кончику виллуса, где в возрасте / поврежденных клеток пролить в люмен7. Равновесие между делением и экструзией клеток позволяет поддерживать кишечные эпителиальные числа клеток, избегая образования зазоров и протечек, а также накопление эпителиальных клеток, потенциально ведущих к клеточным массам и опухолевомугенезу 8,,9,,10. Несмотря на ключевую роль эпителиального пролития клеток в физиологическом обновлении эпителия кишечника, знания о молекулярных механизмах, вождения экструзии клеток на кончике вилюля ограничены. Таким образом, необходимо продать фундаментальные исследования, обеспечивающие точное описание последовательности молекулярных событий, связанных с эпителиальным пролитием клеток.
Сложные взаимодействия между различными типами клеток в слизистой оболочке кишечника являются ключевыми для понимания молекулярных механизмов, регулирующих эпителиальный оборот и кишечный гомеостаз. Таким образом, исследования in vivo предлагают высокие преимущества перед подходами in vitro и ex vivo в этом контексте. Кроме того, методы визуализации в режиме реального времени позволяют описание последовательности событий, контролирующих конкретные явления. В этом контексте изучение высокодинаминых процессов требует использования оптимизированных методов высокого разрешения для прямого наблюдения за тканями. Интравитальные методы визуализации появляются в качестве уникальных подходящих инструментов для изучения эпителиальных клеток пролить в кишечнике.
Термин “интравитальная микроскопия” относится к экспериментальным подходам, воспользовавшись методами визуализации высокого разрешения (мультифотонная или конфокальная микроскопия) для непосредственной визуализации клеток и тканей в их родных окрестностях в пределах живогоживотного 11. Это позволяет в режиме реального времени приобретение информации in vivo до разрешения одной ячейки, и влечет за собой явные преимущества по сравнению со статичными или низкими методами разрешения. Интравитальная микроскопия предоставляет дополнительную информацию и преодолевает некоторые ограничения от классических и/или высококачественных методов, таких как артефакты из-за обработки тканей. В отличие от этого, основным ограничением интравитальной микроскопии является то, что ткань должна быть непосредственно подвержена микроскопу, который в большинстве случаев требует хирургического вмешательства. Хотя сложные подходы сохраняют жизнеспособность и минимизируют воздействие изображенной ткани (камеры кожи и окна длявизуализации) 12,,13,в большинстве случаев выполняется простой разрез кожи для экстернализации тканей (кожных лоскутов)14. В последнее десятилетие эти подходы стали ключевыми свидетельствами о высокодинамих процессах, которые ранее были непостижимыми. Переводно, в режиме реального времени изображения предоставили новые биологические идеи о стволовых клетках и лейкоцитовсамонаведения 15, а также распространениерака и образование метастазов 13,16. В клиническом контексте эндомикроскопия в настоящее время используется в качестве диагностическогоинструмента рака 17 и желудочно-кишечных заболеваний, таких как IBD18,19; в то время как конфокальная мозаичная микроскопия стала инструментом быстрой патологии во времяоперации 20. В совокупности интравитальная микроскопия в последнее время стала ценным и универсальным инструментом для биомедицинских исследований и будущего применения в клинике.
Интравитальная микроскопия здесь реализована для визуализации эпителиальной утечки кишечника в режиме реального времени и наблюдения за эпителиальными явлениями пролития клеток. Утечка кишечной проницаемости может быть идентифицирована другими неинвазивными методами in vivo, такими как количественная оценка перорального введения флуоресцентных трассировщиков всыворотке 21. Тем не менее, этот метод не позволяет прямого наблюдения пролить производительность, ни сегрегации между пара- и транс-клеточной проницаемости. Сочетание стандартных экспериментов трассировщика и интравитальной микроскопии представляет собой подходящий подход к: i) выявлению нарушений в проницаемости кишечника и ii) сегрегации между пара- и трансклеточной эпителиальной проницаемостью. Помимо пролития клеток, интравитальная микроскопия в сочетании с маркировкой флуоресценции in vivo позволяет изучать другие клеточные и молекулярные механизмы (например, жесткое перераспределение соединения во время пролития клеток с использованиемфлуоресцентных мышей-репортеров 22 или взаимодействия между IECs и другими клетками внутри слизистойоболочки кишечника 23).
Представленный здесь метод представляет собой адаптацию интравитальной микроскопии для наблюдения слизистой оболочки кишечника в режиме реального времени с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Таким образом, мы используем условные нокаут мышей GGTase (Geranylgeranyltransferase) в кишечных эпителиальных клеток (IECs) в (Pggt1bi qIEC мышей), так как они страдают от тяжелой кишечной болезни и увеличение эпителиальной проницаемости24. Описана хирургическая подготовка мыши и окрашивание слизистой оболочки кишечника, а также соответствующие настройки, используемые для получения изображений и анализа после приобретения. Этот протокол мог бы позволить будущим исследованиям, способствующим современным знаниям о динамике и кинетике кишечного эпителиального пролития клеток. Кроме того, протокол может послужить основой для различных адаптаций для изучения других явлений, происходящих на поверхности слизистой оболочки кишечника, и даже в других тканях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя технически сложной, интравитальной микроскопии на основе методологии представляет собой уникальный экспериментальный подход к визуализации высокодинаминого клеточного процесса в режиме реального времени, таких, как производительность клеток пролить. До сих пор нет альтернати?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, ведущие к этим результатам, получили финансирование от Программы «Действия людей» (Marie Curie Actions) в соответствии с грантовым соглашением REA No 302170 Седьмой рамочной программы Европейского союза (FP7/2007-2013); Междисциплинарный центр клинических исследований (ИЗКФ) Университета Эрлангена-Нюрнберга; Совместный исследовательский центр TRR241 и Группа клинических исследований KFO257 Немецкого исследовательского совета (DFG); и DFG.
Materials
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | – |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | – |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | – | – |
| LSM microscope SP8 | Leica | – | – |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | – |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | – |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn’s disease: role of CARD15 3020insC mutation?. Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central Role of the Gut Epithelial Barrier in the Pathogenesis of Chronic Intestinal Inflammation: Lessons Learned from Animal Models and Human Genetics. Frontiers in Immunology. 4, 280 (2013).
- Kiesslich, R., et al. Local barrier dysfunction identified by confocal laser endomicroscopy predicts relapse in inflammatory bowel disease. Gut. 61 (8), 1146-1153 (2012).
- Dourmashkin, R. R., et al. Epithelial patchy necrosis in Crohn’s disease. Human Pathology. 14 (7), 643-648 (1983).
- Soderholm, J. D., et al. Augmented increase in tight junction permeability by luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn’s disease. Gut. 50 (3), 307-313 (2002).
- Wittkopf, N., Neurath, M. F., Becker, C. Immune-epithelial crosstalk at the intestinal surface. American Journal of Gastroenterology. 49 (3), 375-387 (2014).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
- Fan, Y., Bergmann, A. Apoptosis-induced compensatory proliferation. The Cell is dead. Long live the Cell!. Trends in Cell Biology. 18 (10), 467-473 (2008).
- Ryoo, H. D., Gorenc, T., Steller, H. Apoptotic cells can induce compensatory cell proliferation through the JNK and the Wingless signaling pathways. Developmental Cell. 7 (4), 491-501 (2004).
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Current Biology. 11 (23), 1847-1857 (2001).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. , (2019).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211 (6), 810-818 (2007).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Nguyen, V. X., Nguyen, C. C., De Petris, G., Sharma, V. K., Das, A. Confocal endomicroscopy (CEM) improves efficiency of Barrett surveillance. Journal of Interventional Gastroenterology. 2 (2), 61-65 (2012).
- Kiesslich, R., Goetz, M., Neurath, M. F. Confocal laser endomicroscopy for gastrointestinal diseases. Gastrointestinal Endoscopy Clinics of North America. 18 (3), 451-466 (2008).
- Kiesslich, R., et al. Chromoscopy-guided endomicroscopy increases the diagnostic yield of intraepithelial neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 132 (3), 874-882 (2007).
- Krishnamurthy, S., et al. Confocal Fluorescence Microscopy Platform Suitable for Rapid Evaluation of Small Fragments of Tissue in Surgical Pathology Practice. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 143 (3), 305-313 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and In vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), 1208-1218 (2011).
- Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
- Lopez-Posadas, R., et al. Rho-A prenylation and signaling link epithelial homeostasis to intestinal inflammation. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 611-626 (2016).
- Duckworth, C. A., Watson, A. J. Analysis of epithelial cell shedding and gaps in the intestinal epithelium. Methods in Molecular Biology. 763, 105-114 (2011).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- Haep, L., et al. Interferon Gamma Counteracts the Angiogenic Switch and Induces Vascular Permeability in Dextran Sulfate Sodium Colitis in Mice. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (10), 2360-2371 (2015).
- Lopez-Posadas, R., et al. Inhibiting PGGT1B Disrupts Function of RHOA, Resulting in T-cell Expression of Integrin alpha4beta7 and Development of Colitis in Mice. Gastroenterology. , (2019).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
