Apresentado aqui é um método seguro e eficaz para infectar larvas de zebrafish com c. anaeróbico fluorescente rotulado por microinjeção e microgavage não invasivo.
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Artigo de método
Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile
Neste artigo
Resumo
Resumo
A infecção por clostridioides difficile (CDI) é considerada uma das infecções gastrointestinais mais comuns associadas à saúde nos Estados Unidos. A resposta imune inata contra C. difficile foi descrita, mas os papéis exatos dos neutrófilos e macrófagos no CDI são menos compreendidos. No presente estudo, larvas de Danio rerio (zebrafish) são usadas para estabelecer um modelo de infecção por C. difficile para a imagem do comportamento e cooperação dessas células imunes inatas inatas inatas invivas. Para monitorar C. difficile, foi estabelecido um protocolo de rotulagem usando um corante fluorescente. Uma infecção localizada é alcançada pela microinjeção rotulada de C. difficile, que cresce ativamente no trato intestinal de zebrafish e imita o dano epitelial intestinal no CDI. No entanto, esse protocolo de infecção direta é invasivo e causa feridas microscópicas, que podem afetar os resultados experimentais. Assim, um protocolo microgavage mais não invasivo é descrito aqui. O método envolve a entrega de células C. difficile diretamente no intestino de larvas de zebrafish por intubação através da boca aberta. Este método de infecção imita de perto a rota de infecção natural de C. difficile.
Introdução
C. difficile é um bacilo produzido por esporos, anaeróbico e produtor de toxinas que é a principal causa de infecções graves no trato gastrointestinal1. Os sintomas típicos do CDI incluem diarreia, dor abdominal e colite pseudomembrannosa fatal, e às vezes pode levar à morte1,2. Evidências mostraram que as respostas imunes hospedeiras desempenham um papel crítico tanto na progressão quanto no resultado desta doença3. Além da resposta imune, a microbiota intestinal indígena é crucial para o início e a patogênese do CDI4. Na última ....
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Protocolo
Todo o trabalho animal descrito aqui foi realizado de acordo com as normas legais (DIRETIVA UE 2010/63, licença AZ 325.1.53/56.1-TUBS e licença AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Preparação de Agarose de Baixo Derretimento, Placa de Gel e Agulhas microinjeção/microgavage
- Dissolver 0,08 g de agarose de baixo derretimento (Tabela de Materiais, agarose A2576) em 10 mL de 30% danieau médio (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) e 17,4 mM NaCl, armazenados à temperatura ambiente (RT) para obter uma solução de 0,8%.
NOTA: Podem ser utilizadas concentrações....
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Resultados
C. difficile é estritamente anaeróbico, mas o cromosforo de proteínas fluorescentes geralmente requer oxigênio para amadurecer. Para superar esse problema, um corante fluorescente foi usado para manchar células c. difficile vivas que estavam crescendo ativamente (R20291, uma cepa ribótipo 027; Figura 1A). Usando o sistema Gal4/UAS, foram geradas linhas de zebrafish transgênicas estáveis para imagens vivas, nas quais os promotores mpeg1.1 ou lyZ.......
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Discussão
Os métodos apresentados modificam e estendem uma abordagem existente para infectar larvas de zebrafish realizando injeção e microgavage10,14. Também demonstra uma abordagem para estudar patógenos anaeróbicos com larvas de zebrafish22. Além disso, o protocolo facilita a análise das respostas inatas das células imunes inatos no vivo sobre o CDI e após a colonização de C. difficile em zebrafish. O método é reprodutível e fácil de rea.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Somos gratos a Timo Fritsch por um excelente cuidado animal. Agradecemos aos membros dos laboratórios Köster e Steinert por apoio e discussões úteis. Agradecemos ao Dr. Dandan Han por ler o manuscrito. Reconhecemos com gratidão o financiamento do Estado Federal da Baixa Saxônia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Agarose gelificante ultrabaixa |
| Bagrose de baixo ponto de fusão (LM) | Pronadisa | 8050 | É usado em placas de agarose |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Corante fluorescente |
| Caldo de infusão cérebro-coração | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Latão (tipo selvagem) | deficiente na síntese de melanina, usado para gerar linhas transgênicas estáveis | ||
| Nitrato de cálcio (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Vidro Capilar | Harvard Apparatus | 30-0019 | Agulhas de injeção |
| Clostridioides difficile | R20291,, uma cepa de ribotipo 027, produção de TcdA+/TcdB+/CDT+ | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| Plataforma de | código | Processamento de imagem | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Extrator de agulha horizontal | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cisteína | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Processamento de imagem | |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injetor | eppendorf | 5253000017 | |
| Moldes de microinjeção | Ferramentas científicas adaptáveis | TU1 | |
| Microscópio confocal Leica SP8 | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocolato | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable linhagem transgénica na qual os promotores de lyZ conduzem a expressão da proteína fluorescente EGFP em neutrófilos | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable linha transgênica em que o mpeg1.1 conduz a expressão da proteína fluorescente EGFP em macrófagos | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Extrato de levedura | BD Bacto | 212750 |
Referências
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al.
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Reimpressões e permissões
