Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar e analisar as artérias do arco faríngeo 3, 4 e 6 dos embriões de camundongos usando imunofluorescência de montagem total, limpeza de tecidos, microscopia confocal e reconstrução 3D.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Visualização e Análise de Artérias ariníngeos usando Imunohistoquímica de montagem integral e Reconstrução 3D
Neste artigo
Resumo
Resumo
A formação inadequada ou a remodelação das artérias do arco faríngeo (PAAs) 3, 4 e 6 contribuem para algumas das formas mais graves de doença cardíaca congênita. Para estudar a formação de PAAs, desenvolvemos um protocolo utilizando imunofluorescência de montagem completa juntamente com a limpeza de tecido de álcool benzílico/benzoato de benzílico (BABB) e microscopia confocal. Isso permite a visualização do endotélio do arco faríngeo em uma resolução celular fina, bem como a conectividade 3D da vasculatura. Usando software, estabelecemos um protocolo para quantificar o número de células endoteliais (CEIs) em PAAs, bem como o número de CE dentro do plexo vascular em torno dos PAAs dentro dos arcos faríngea3, 4 e 6. Quando aplicada a todo o embrião, essa metodologia proporciona uma visualização abrangente e análise quantitativa da vasculatura embrionária.
Introdução
Durante a embriogênese do camundongo, as artérias arqueína faríngeas (PAAs) surgem como pares bilaterais simétricos de artérias que conectam o coração com a aortae dorsal1. À medida que o embrião se desenvolve, o primeiro e o segundo pares de PAAs regredem, enquanto os3º,4ºe6º PAAs passam por uma série de eventos de remodelação assimétrica para formar as artérias arqueoréticas2.
Os PAAs 3, 4 e 6 desenvolvem-se através da vasculogênese, que é a formação de novo dos vasos sanguíneos3. Defeitos na formação ou remodelação dessas artérias arq....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O uso e os procedimentos de uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade Rutgers.
1. Elaboração de soluções
- Prepare 1 L de solução salina tamponada com 0,1% Triton-X-100 (PBST) e esterilização do filtro. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT) por pelo menos um ano.
- Prepare 600 μL de tampão de bloqueio composto por 10% do soro de burro normal em PBST. Faça esta solução fresca cada vez.
- Prepare 50 mL das seguintes diluições de metanol (MeOH) em uma capa de fluxo: 25% MeOH em água deionizada (dH2O), 50% MeOH em dH2
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O protocolo de imunofluorescência de montagem completa aqui apresentado produz resultados claros e limpos, permitindo a reconstrução 3D do endotélio do arco faríngeo, como visto na Figura 1A. É importante incubar embriões por tempo suficiente em cada solução de anticorpos para garantir a penetração completa através da amostra, bem como, lavar completamente os embriões após a incubação de anticorpos. Na Figura 1
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A capacidade de visualizar o endotélio em embriões de camundongos em 3D forneceu novas percepções sobre seu desenvolvimento3. Aqui apresentamos um protocolo que permite imagens 3D de alta resolução de embriões, visualização da conectividade vascular e análises quantitativas da formação de PAA. Este protocolo pode ser empregado para ver como alterações genéticas ou insultos ambientais afetam o desenvolvimento do PAA. O procedimento aqui relatado utiliza anticorpos contra VEGFR2 e ERG para visualiza.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Brianna Alexander, Caolan O'Donnell e Michael Warkala pela leitura e edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do National Heart, Lung and Blood Institute do NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 para SA; A AJR é apoiada pelo NHLBI HL103920-08S1 e pelo Instituto Nacional de Artrite e Treinamento de Doenças Musculoesqueléticas e de Pele grant T32052283-11.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x objetiva de imersão em água | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-cabra | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Software | de análiseImaris 9.2.0 | ||
| Álcool Benzílico | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzoato de Benzila | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Lamínulas | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (estoque de 5 mg/mL) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Etanol | VWR | 89370-084 | |
| Tubos Falcon (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Poços rápidos | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Fórceps | Roboz | RS-5015 | |
| Cabra anti-VEGFR2 | R& D Sistemas, Inc. | AF644 | |
| Metanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscópio | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Soro de burro normal | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Microscopia Eletrônica | de Paraformaldeído | 15710 | |
| Pipetas Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Placas de Petri (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Placas de Petri (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Moldes de plástico | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
Referências
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
