Visualisering og analyse av farynle arterier ved hjelp av hele mount immunohistokjemi og 3D rekonstruksjon
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere og analysere de faryngeale buearteriene 3, 4 og 6 av museembryoer ved hjelp av hele mount immunofluorescens, vevsydding, konfokal mikroskopi og 3D-rekonstruksjon.
Abstract
Feil dannelse eller ombygging av farynleskearteriene (PAAer) 3, 4 og 6 bidrar til noen av de mest alvorlige formene for medfødt hjertesykdom. For å studere dannelsen av PAAer utviklet vi en protokoll ved hjelp av hele mount immunofluorescens kombinert med benzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) vevsrydding og konfokal mikroskopi. Dette gjør det mulig for visualisering av faryngitteret i enfin cellulær oppløsning samt 3D-tilkoblingen til vaskulaturen. Ved hjelp av programvare har vi etablert en protokoll for å kvantifisere antall endotelceller (ECer) i PAAer, samt antall ECer i vaskulær plexus rundt PAAer innenfor farynlesbuer 3, 4 og 6. Når den brukes på hele embryoet, gir denne metodikken en omfattende visualisering og kvantitativ analyse av embryonalvaskulatur.
Introduction
Under museembryogenese oppstår faryngeal erkearterier (PAAer) som symmetriske, tosidige par arterier som forbinder hjertet med den dorsal aortae1. Som embryoet utvikler seg, gjennomgår de første og andre parpaene av PAAs regress, mens 3rd, 4th, og 6th PAAs gjennomgår en rekke asymmetriske remodeling hendelser for å danne aortaerinarteriene2.
PaAs 3, 4 og 6 utvikler seg via vaskuogenese, som er de novo-dannelsen av blodkar3. Defekter i dannelsen eller ombygging av disse erkearteriene gir opphav til ulike medfødte hjertefeil, slik som de som er sett hos pasienter med DiGeorge syndrom4,5. Derfor kan forståelse av mekanismer som regulerer utviklingen av PAAer føre til en bedre forståelse av medfødt hjertesykdom (CHD) etiologi.
Nåværende tilnærminger for visualisering og analyse av PAA-utvikling inkluderer immunfluorescens av vevsseksjoner, vaskulære støperier, India blekkinjeksjon, høy oppløsning episkopisk mikroskopi, og / eller helmontert immunohistochemistry1,4,5,6,7. Her beskriver vi en protokoll som kombinerer hele mount immunofluorescens, konfokal mikroskopi og 3D-bildegjengivelse for å samle inn, analysere og kvantifisere volumetriske data, vaskulær tilkobling og celleidentitet. Videre beskriver vi en metode for å compartmentalize og kvantifisere antall ECer i hver faryngeal bue som et middel til å studere dannelsen av faryngeal bue vaskulær plexus og dens ombygging i PAAs. Mens denne protokollen er designet for å analysere PAA-utvikling, kan den brukes til å analysere andre utviklende vaskulære nettverk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evnen til å visualisere endotelet i museembryoer i 3D har gitt ny innsikt i deres utvikling3. Her presenterer vi en protokoll som muliggjør høyoppløselig 3D-avbildning av embryoer, visualisering av vaskulær tilkobling og kvantitative analyser av PAA-dannelse. Denne protokollen kan brukes for å se hvordan genetiske endringer eller miljøfornærmelser påvirker PAA-utviklingen. Prosedyren som rapporteres her bruker antistoffer mot VEGFR2 og ERG for å visualisere PAA-dannelse og kvantifisere E…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Brianna Alexander, Caolan O’Donnell og Michael Warkala for nøye lesing og redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av finansieringen fra National Heart, Lung and Blood Institute of nih R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 til SA; AJR støttes av NHLBI HL103920-08S1 og National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Training grant T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
Referências
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Biologia do Desenvolvimento. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
