Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi
Summary
Burada, faringeal kemer arterlerin 3, 4 ve 6’sını tam montaj lı immünororesans, doku temizleme, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol uyguluyoruz.
Abstract
Faringeal kemer arterlerin (PAAs) 3, 4 ve 6’nın yanlış oluşumu veya yeniden biçimlendirilmesi konjenital kalp hastalığının en şiddetli formlarından bazılarına katkıda bulunur. PAAs oluşumunu incelemek için, benil alkol /benzil benzoat (BABB) doku temizleme ve konfokal mikroskopi ile birleştiğinde tam montaj immünororesans kullanarak bir protokol geliştirdik. Bu ince bir hücresel çözünürlükte faringeal kemer endotel görselleştirme yanı sıra vaskülatür 3D bağlantısı sağlar. Yazılımı kullanarak, PAAs endotel hücrelerinin (ECs) sayısını ölçmek için bir protokol kurduk, yanı sıra faringeal kemerler içinde PAAs çevreleyen vasküler pleksus içinde ECs sayısı 3, 4, ve 6. Tüm embriyouygulandığında, bu metodoloji embriyonik vaskülatür kapsamlı bir görselleştirme ve kantitatif analiz sağlar.
Introduction
Fare embriyogenezi sırasında, faringeal arch arterler (PAAs) dorsal aort ile kalp bağlamak arterlerin simetrik, çift taraflı çiftleri olarak ortaya çıkar1. Embriyo geliştikçe, PAAs ilk ve ikinci çiftleri regress, süre 3,4th, ve6 PAAs aort kemer arterler oluşturmak için asimetrik remodeling olaylar bir dizi geçmesi2.
PAAs 3, 4 ve 6 vaskülogenez yoluyla gelişir, hangi kan damarlarının de novo oluşumudur3. Bu kemer arterlerin oluşumu veya remodeling kusurları çeşitli konjenital kalp defektleri yol açar, DiGeorge Sendromu olan hastalarda görülen gibi4,5. Bu nedenle PAA’ların gelişimini düzenleyen mekanizmaların anlaşılması konjenital kalp hastalığı (KH) etiyolojisinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
PAA gelişimini görselleştirmek ve analiz etmek için güncel yaklaşımlar arasında doku kesitlerinin immünororesansı, vasküler dökümler, Hindistan mürekkep enjeksiyonu, yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi ve/veya tam montajlı immünohistokimya1,4,5,,6,7sayılabilir. Burada, hacimsel verileri, vasküler bağlanabilirliği ve hücre kimliğini toplamak, analiz etmek ve ölçmek için tam bir immünofofloresans, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu görüntü oluşturmayı birleştiren bir protokol tanımlıyoruz. Ayrıca, faringeal kemer vasküler pleksus oluşumu nu incelemek ve PAAs içine remodeling bir araç olarak her faringeal kemer EC’lerin sayısını bölümlere ayırmak ve ölçmek için bir yöntem detay. Bu protokol PAA gelişimini analiz etmek için tasarlanmış olsa da, diğer gelişmekte olan vasküler ağları analiz etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D fare embriyolarında endotel görselleştirmek için yeteneği onların gelişimi içine yeni anlayışlar sağlamıştır3. Burada embriyoların yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme, vasküler bağlantı nın görselleştirilmesi ve PAA oluşumunun kantitatif analizleri için izin veren bir protokol sıyoruz. Bu protokol, genetik değişikliklerin veya çevresel hakaretlerin PAA gelişimini nasıl etkilediğini görmek için kullanılabilir. Burada bildirilen prosedür, PAA oluşumunu …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Brianna Alexander, Caolan O’Donnell ve Michael Warkala’ya bu el yazmasının dikkatli okumaları ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 SA tarafından finanse edildi; AJR NHLBI HL103920-08S1 ve Ulusal Artrit Enstitüsü ve Kas-Iskelet ve Cilt Hastalıkları Eğitimi hibe T32052283-11 tarafından desteklenir.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
Referências
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Biologia do Desenvolvimento. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
