مجتمعة الضربة القاضية المشروطة وتكييف المجال تشكيل الفحص لدراسة جين الجذعية المرتبطة بالخلايا الجذعية سرطان المعدة المستمدة من المريض
Summary
في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة ومقايسة تشكيل الكرة المكيفة لدراسة تأثير التكتل على جذع GCSCs المشتق من المريض. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة كل من في المختبر وفي وظيفة الجسم الحي للجينات المرتبطة بالرباط في أنواع مختلفة من CSCs.
Abstract
وتورط الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في بدء الورم، والتنمية وتكرار بعد العلاج، وأصبحت مركز اهتمام العديد من الدراسات في العقود الماضية. ولذلك، من المهم تطوير أساليب للتحقيق في دور الجينات الرئيسية المشاركة في الخلايا السرطانية الجذعية. سرطان المعدة (GC) هو واحد من أكثر أنواع السرطان شيوعاً وفانياً. ويعتقد أن الخلايا الجذعية سرطان المعدة (GCSCs) لتكون جذر الانتكاس سرطان المعدة, الانبثاث ومقاومة المخدرات. هناك حاجة إلى فهم علم الأحياء GCSS لدفع تطوير العلاجات المستهدفة وفي نهاية المطاف للحد من الوفيات بين المرضى. في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة ومقايسة تشكيل الكرة المكيفة لدراسة تأثير التكتل على جذع GCSCs المشتق من المريض. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة كل من في المختبر وفي وظيفة الجسم الحي للجينات المرتبطة بالرباط في أنواع مختلفة من CSCs.
Introduction
سرطان المعدة (GC) هو واحد من أكثر أنواع السرطانات شيوعاً وفانياً1. على الرغم من التقدم في الجراحة المشتركة, العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي في العلاج GC, التكهن لا يزال ضعيفا ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لا يزال منخفضا جدا2. تكرار و الانبثاث هي الأسباب الرئيسية التي تسبب وفيات ما بعد العلاج.
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية التي تمتلك القدرة على تجديد الذات وتوليد أنساب الخلايا المختلفة التي تعيد تشكيل الورم3. ويعتقد أن CSCs مسؤولة عن الانتكاس السرطان والنقائل بسبب قدراتها على تجديد الذات وبذر الأورام الجديدة، فضلا عن مقاومتها للعلاج الكيميائي التقليدي- والعلاجات الإشعاعية4. ولذلك، فإن استهداف مراكز خدمات الصحة وتكميل الأطفال والقضاء على الإيدز يوفران إمكانات مثيرة لتحسين العلاج والحد من وفيات مرضى السرطان.
وقد تم عزل CSCs من أنواع كثيرة من الأورام الصلبة5. في عام 2009، تم وصف الخلايا الجذعية سرطان المعدة (GCSCs) معزولة عن خطوط خلايا سرطان المعدة البشرية أصلا من قبل Takaishi وآخرون6. شين وزملاؤه أول تحديد ونقاء GCSCs من الغدة الغدة في المعدة البشرية (GAC) أنسجة الورم7. هذه النتائج لا توفر فرصة لدراسة علم الأحياء GCSS فحسب ، بل توفر أيضًا أهمية سريرية كبيرة.
ومن الخصائص الخاصة لCsSCs قدرتها على تشكيل المجال8. يتم وضع مطلي في الخلايا الفردية في ظروف غير مُضَمَّة بكثافة منخفضة، والخلايا التي تمتلكها ذاتية التجديد هي وحدها التي يمكن أن تنمو لتصبح كتلة صلبة كروية تسمى كرة. وهكذا، فإن تحليل تكوين المجال قد اعتبر معيار الذهب والتقييس وتستخدم على نطاق واسع لتقييم الخلايا الجذعية إمكانية التجديد الذاتي في المختبر.
تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو أداة بحثية قوية لدراسة وظيفة الجينات من قبل الضربة القاضية من جين محدد9. ومع ذلك ، فإن التكنولوجيات الجينية المستقرة على المدى الطويل لها بعض القيود ، مثل التحدي المتمثل في استكشاف وظيفة الجين الضروري لبقاء الخلية. يمكن أن تكون أنظمة RNAi الشرطية مفيدة في التنطي السفلي للجينات المرغوبة بطريقة زمنية و/أو خاصة خاضعة للرقابة من خلال إدارة عامل محفز. وtratecline (التيت)-نظم غير قابلة للانطلاق هي واحدة من أنظمة RNAi الشرطية الأكثر استخداما على نطاق واسع10. يمكن للأنظمة التيت غير القابلة للحث على إسكات الجينات المستهدفة من خلال التحكم في التعبير عن shRNA عند إضافة محفز خارجي (دوكسيسيكلين بشكل تفضيلي ، Dox). يمكن تقسيم أنظمة Tet-inducible إلى نوعين: أنظمة Tet-On أو Tet-Off. يمكن تشغيل التعبير عن shRNA (Tet-On) أو إيقاف تشغيله (Tet-Off) في وجود المستحث. في نظام Tet-ON بدون مستحث، يرتبط مكابر Tet (Tet) (Tet) المعبّر عنه بشكل مكوّن بسلسلة عناصر تيت مستجيبة (TRE) التي تحتوي على مروج معتمد على Pol III مستجيب للتيت للتعبير عن SHRNA، وبالتالي قمع التعبير عن shRNA. في حين أن على إضافة دوكس، يتم عزل TetR بعيدا عن المروج التي تستجيب Tet Pol III. وهذا يسهل التعبير عن shRNA ويؤدي إلى ضربة قاضية الجينات.
البروتوكول الموصوف هنا يستخدم نظام شرنا التتراسيكلين الوظيفية غير القابلة للتكريس ومقايسة تكوين المجال المتكيف لدراسة وظيفة التكتل في GCSCs المشتقة من المريض.11 نستخدم البروتوكول الموصوف لدراسة آثار التكتل في التجديد الذاتي GCSCs. هذه المنهجية تنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا الجذعية السرطانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
GC هو السبب الرئيسي الثالث للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. GCSCs حاسمة في الانتكاس سرطان المعدة, الانبثاث ومقاومة المخدرات. استخدام GCSCs من مرضى سرطان المعدة سوف تسمح لنا لاستكشاف نقطة ضعفهم وتطوير الأدوية المستهدفة لعلاج مرضى GC.
اختبار تكوين المجال هو وسيلة مفيد…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل من قبل مؤسسة علوم الطبيعة في مقاطعة قوانغدونغ (2018A030310586، 2020A1515010989، مؤسسة البحوث العلمية الطبية لمقاطعة قوانغدونغ (A2019405)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772957)، والعلوم و برنامج التكنولوجيا لمقاطعة قوانغدونغ في الصين (2017B030301016)، ومؤسسة الصناعة وتكنولوجيا المعلومات في شنتشن (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
Referências
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
