Knockdown condizionale combinato e formazione di sfere adattate Per studiare un gene associato alla staminalizza delle cellule staminali del cancro gastrico derivato dal paziente
Summary
In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l’effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicate nell’iniziazione del tumore, nello sviluppo e nella recidiva dopo il trattamento e sono diventate al centro dell’attenzione di molti studi negli ultimi decenni. Pertanto, è importante sviluppare metodi per studiare il ruolo dei geni chiave coinvolti nella staminalità delle cellule tumorali. Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di cancro. Si ritiene che le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) siano la radice della ricaduta del cancro gastrico, della metastasi e della resistenza ai farmaci. Comprendere la biologia dei GCSCs è necessario per far progredire lo sviluppo di terapie mirate e, infine, per ridurre la mortalità tra i pazienti. In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l’effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.
Introduction
Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di tumori1. Nonostante i progressi nella chirurgia combinata, chemioterapia e radioterapia nella terapia GC, la prognosi rimane scarsa e il tasso di sopravvivenza a cinque anni è ancora molto basso2. La ricorrenza e la metastasi sono le ragioni principali che causano i decessi post-trattamento.
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono un sottoinsieme di cellule tumorali che possiedono la capacità di auto-rinnovarsi e generare le diverse linee cellulari che ricostituire il tumore3. Si ritiene che i CSC siano responsabili della ricaduta e della metastasi del cancro a causa delle loro capacità di auto-rinnovamento e semina di nuovi tumori, così come la loro resistenza alle tradizionali chemio e radioterapie4. Pertanto, il targeting per i CSC e l’eliminazione delle CSC offrono un potenziale entusiasmante per migliorare il trattamento e ridurre la mortalità dei pazienti oncologici.
I CSC sono stati isolati da molti tipi di tumori solidi5. Nel 2009, le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) isolate dalle linee cellulari del cancro gastrico umano sono state originariamente descritte da Takaishi et al.6. Chen e colleghi hanno in primo luogo identificato e purificato i GCSC dai tessuti tumorali dell’adenocarcinoma gastrico umano (GAC)7. Questi risultati non solo forniscono l’opportunità di studiare la biologia dei GCSCs, ma forniscono anche grande importanza clinica.
Una caratteristica particolare dei CSC è la loro capacità di formare una sfera8. Le singole cellule sono placcate in condizioni non aderenti a bassa densità, e solo le cellule possedute dall’auto-rinnovamento possono crescere in un solido ammasso sferico chiamato sfera. Pertanto, il saggio sulla formazione della sfera è stato considerato come il saggio gold standard e ampiamente utilizzato per valutare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali in vitro.
L’interferenza dell’RNA (RNAi) è un potente strumento di ricerca per studiare la funzione genica mediante l’abbattimento di un genespecifico 9. Tuttavia, le tecnologie di abbattimento genico stabili a lungo termine hanno alcune limitazioni, come la sfida di esplorare la funzione di un gene che è essenziale per la sopravvivenza cellulare. I sistemi RNAi condizionali possono essere utili per la downregolazione dei geni desiderati in modo temporale e/o controllato speciale dalla somministrazione di un agente induttivo. I sistemi indutbili di tetraciclina (Tet) sono uno dei sistemi RNAi condizionali più utilizzati10. I sistemi indutbili di Tet possono indurre il silenziamento genico bersaglio controllando l’espressione dello shRNA su aggiunta di un induttore esogeno (preferibilmente doxycycline, Dox). I sistemi Tet-inducible possono essere suddivisi in due tipi: sistemi Tet-On o Tet-Off. L’espressione di shRNA può essere attivata (Tet-On) o spenta (Tet-Off) in presenza dell’indottore. Nel sistema Tet-ON senza un induttore, il reprimere Tet (TetR) espresso in modo costitutivo si lega alla sequenza di elementi Tet-responsive (TRE) contenente un promotore dipendente da Pol III per l’espressione shRNA, reprimendo così l’espressione dello shRNA. Mentre su aggiunta di Dox, il TetR è sequestrato lontano dal promotore Tet-responsive Pol III-dipendente. Questo facilita l’espressione dello shRNA e porta al knockdown genico.
Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di shRNA inducibile in tetraciclino funzionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare la funzione della clusterina nei GCSC derivati dalpaziente. Usiamo il protocollo descritto per studiare gli effetti della clusterina nell’auto-rinnovo dei GCSC. Questa metodologia è applicabile anche ad altri tipi di cellule staminali tumorali.
Protocol
Representative Results
Discussion
La GC è la terza causa di morte legata al cancro in tutto il mondo. I GCSC sono fondamentali nella ricaduta del cancro gastrico, nella metastasi e nella resistenza ai farmaci. L’utilizzo di GCSC da pazienti affetti da cancro gastrico ci permetterà di esplorare il loro punto debole e sviluppare i farmaci di targeting per il trattamento dei pazienti affetti da GC.
Il saggio sulla formazione della sfera è un metodo utile per esaminare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nature Science Foundation della provincia del Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), la Medical Scientific Research Foundation della Provincia del Guangdong (A2019405), la National Natural Science Foundation of China (81772957), la Science and Programma tecnologico della provincia del Guangdong in Cina (2017B030301016) e la Industry and Information Technology Foundation di Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
Referências
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