Комбинированные Условный Нокдаун и Адаптированные Сфера Формирование Анализ для изучения Stemness-Ассоциированный ген пациента полученных стволовых клеток рака желудка

Summary

В этом протоколе мы представляем экспериментальную конструкцию с использованием условной нокдаунной системы и адаптированного анализа формирования сферы для изучения влияния кластерина на ствольность ГКС, полученных пациентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения как in vitro, так и in vivo функции генов, связанных со стволом, в различных типах CSC.

Abstract

Раковые стволовые клетки (ККС) вовлечены в инициирование опухоли, развитие и рецидив после лечения, и стали центром внимания многих исследований в последние десятилетия. Поэтому важно разработать методы исследования роли ключевых генов, участвующих в стволе раковых клеток. Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных и смертных видов рака. Стволовые клетки рака желудка (GCSCs), как полагают, корень рецидива рака желудка, метастазы и лекарственной устойчивости. Понимание биологии GCSCs необходимо для продвижения разработки целевых методов лечения и, в конечном итоге, для снижения смертности среди пациентов. В этом протоколе мы представляем экспериментальную конструкцию с использованием условной нокдаунной системы и адаптированного анализа формирования сферы для изучения влияния кластерина на ствольность ГКС, полученных пациентом. Протокол может быть легко адаптирован для изучения как in vitro, так и in vivo функции генов, связанных со стволом, в различных типах CSC.

Introduction

Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных и смертных видов рака¹. Несмотря на достижения в комбинированной хирургии, химиотерапии и лучевой терапии в терапии GC, прогноз остается плохим и пятилетнюю выживаемость по-прежнему очень низка². Рецидив и метастазы являются основными причинами смерти после лечения.

Раковые стволовые клетки (CSCs) являются подмножеством раковых клеток, которые обладают способностью к самообновлению и генерации различных клеточных линий, которые воссоздают^{опухоль 3}. CSCs, как полагают, несет ответственность за рецидив рака и метастазы из-за их возможности самооб обновления и посева новых опухолей, а также их устойчивость к традиционной химиотерапии и^{радиотерапевтии 4}. Таким образом, ориентация на CSCs и устранение CSCs обеспечивают захватывающий потенциал для улучшения лечения и снижения смертности онкологических больных.

CSCs были изолированы от многих типов твердых опухолей^5. В 2009 году стволовые клетки рака желудка (GCSCs), изолированные от линий раковых клеток человека, были первоначально описаны Takaishi et al.^6. Чэнь и его коллеги впервые определили и очищали GCSCs от аденокарциномы желудка человека (GAC) опухолевых тканей⁷. Эти выводы не только дают возможность изучать биологию GCSCs, но и обеспечивают большое клиническое значение.

Особенностью ККС является их способность формировать сферу^8. Одиночные клетки поцаряются в неадхерентных условиях при низкой плотности, и только клетки, одержимые самообъемом, могут вырасти в твердое сферическое скопление, называемое сферой. Таким образом, анализ формирования сферы был расценен как анализ золотого стандарта и широко используется для оценки потенциала самообжиления стволовых клеток in vitro.

РНК-интерференция (РНК) является мощным инструментом исследования для изучения функции генов путем нокдауна конкретного гена^9. Тем не менее, долгосрочные стабильные технологии нокдауна генов имеют определенные ограничения, такие как проблема изучения функции гена, который имеет важное значение для выживания клеток. Условные системы РНК могут быть полезны для downregulation желаемых генов в височной и / или специально контролируемой образом администрации индуцирующего агента. Тетрациклин (Tet)-неуявимые системы являются одной из наиболее широко используемых условных систем РНК¹⁰. Системы Tet-inducible могут навести глушитель гена цели путем контролировать выражение shRNA на добавлении exogenous индуктора (преимущественно doxycycline, Dox). Системы Tet-inducible можно разделить на два типа: Tet-On или Tet-Off. Выражение shRNA может быть включено (Tet-On) или выключено (Tet-Off) в присутствии индуктора. В системе Tet-ON без индуктора, constitutively выраженный репрессор Tet (TetR) связывает к последовательности Tet-responsive элемента (TRE) содержа Tet-отзывчивый Pol III-зависимый промоутер для выражения shRNA, таким образом подавляя выражение shRNA. В то время как после добавления Dox, TetR улавливлен от Tet-реакции Pol III-зависимого промоутера. Это облегчает экспрессию шРНК и приводит к гену нокдаун.

Протокол, описанный здесь использует функциональную тетрациклин-индуцированную shRNA систему и адаптированный анализ формирования сферы для изучения функции кластерина в пациент-производных GCSCs. Clusterin был определен как новая ключевая молекула для поддержания стволовости и выживания GCSCs в предыдущем^{исследовании 11}. Мы используем описанный протокол для изучения влияния кластерина в самообувечении GCSCs. Эта методология также применима к другим типам раковых стволовых клеток.

Protocol

Все эксперименты с использованием пациентов полученных стволовых клеток рака желудка, описанных в этом был одобрен местным комитетом по этике7. 1. Культура стволовых клеток рака желудка Подготовка GCSCs полной среды культуры Подготовка GCSCs полной сре…

Representative Results

Стволовые клетки рака желудка из первичной аденокарциномы желудка человека были выучинены в среде культуры, свободной от сыворотки. Через 6 дней клетки расширились от одноклеточного фенотипа(рисунок 1А)до больших сфер(рисунок 1</stron…

Discussion

ГК является третьей по величине причиной смерти, связанной с раком, во всем мире. GCSCs имеют решающее значение в рецидив рака желудка, метастазы и лекарственной устойчивости. Использование GCSCs от больных раком желудка позволит нам исследовать их слабое место и разработать целевые препар?…

Materials

0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1