यह पांडुलिपि बाह्य रिसेप्टर-लिगामेंट इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए जीनोम-स्केल सेल-आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का वर्णन करती है।
झिल्ली-एम्बेडेड कोशिका सतह रिसेप्टर्स के बीच सीधी बातचीत द्वारा मध्यस्थता अंतरकोशिकीय संचार बहुकोशिकीय जीवों के सामान्य विकास और कामकाज के लिए महत्वपूर्ण है। इन बातचीत का पता लगाना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, लेकिन । यह पांडुलिपि एक व्यवस्थित जीनोम-स्केल CRISPR/Cas9 नॉकआउट जेनेटिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का वर्णन करती है जो विशिष्ट सेल सतह मान्यता घटनाओं के लिए आवश्यक सेलुलर रास्तों का पता चलता है । यह परख एक कोशिका आधारित आनुवंशिक स्क्रीन में बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए शौकीन चावला बाध्यकारी जांच के रूप में एक स्तनधारी प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित पुनः संयोजन प्रोटीन का उपयोग करता है । इस विधि का उपयोग झिल्ली-एम्बेडेड रिसेप्टर्स के एक्टोडोमेन के अनुरूप पुनः संयोजन बाध्यकारी जांच द्वारा पाए गए कोशिका सतह बातचीत के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण के जीनोम पैमाने प्रकृति को देखते हुए, यह भी न केवल प्रत्यक्ष रिसेप्टर की पहचान करने का लाभ है, लेकिन यह भी सेलुलर घटक है कि सेल की सतह पर रिसेप्टर की प्रस्तुति के लिए आवश्यक हैं, जिससे रिसेप्टर के जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।
सेल सरफेस रिसेप्टर प्रोटीन द्वारा एक्स्ट्रासेलुलर इंटरैक्शन ऊतक संगठन, मेजबान-रोगजनक मान्यता और प्रतिरक्षा विनियमन जैसे महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को प्रत्यक्ष करता है। इन बातचीत की जांच व्यापक जैव चिकित्सा समुदाय के लिए ब्याज की है, क्योंकि झिल्ली रिसेप्टर्स व्यवस्थित रूप से वितरित चिकित्सा जैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के कार्रवाई योग्य लक्ष्य हैं। उनके महत्व के बावजूद, इन बातचीत का अध्ययन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है । यह मुख्य रूप से इसलिए है क्योंकि झिल्ली-एम्बेडेड रिसेप्टर्स एम्फीपैथिक होते हैं, जिससे उन्हें जैव रासायनिक हेरफेर के लिए जैविक झिल्ली से अलग करना मुश्किल हो जाता है, और उनकी बातचीत कमजोर बातचीत एफिनिटीज (माइक्रोएम-एमएम रेंज मेंकेडीएस)1द्वारा टाइप की जाती है। नतीजतन, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कई तरीके प्रोटीन इंटरैक्शन1,,2के इस वर्ग का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त हैं।
विशेष रूप से बाह्य रिसेप्टर-लिगामेंट इंटरैक्शन की जांच करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं जो उनके अद्वितीय जैव रासायनिक गुणों को ध्यान में रखते हैं3। इनमें से कई दृष्टिकोणों में स्तनधारी या कीट कोशिका आधारित प्रणालियों में घुलनशील पुनः संयोजन प्रोटीन के रूप में रिसेप्टर के पूरे ectodomain को व्यक्त करना शामिल है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इन प्रोटीनों में पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन होते हैं जो संरचनात्मक रूप से महत्वपूर्ण होते हैं, जैसे ग्लाइकान और डिसल्फाइड बांड। कम आत्मीयता बाध्यकारी को दूर करने के लिए, एक्टोडोमेन अक्सर अपनी बाध्यकारी avidity बढ़ाने के लिए ओलिगोमर्माइज्ड होते हैं। शौकीन चावला प्रोटीन एक्टोडोमेन का सफलतापूर्वक उपयोग बाध्यकारी जांच के रूप में किया गया है ताकि प्रत्यक्ष पुनः संयोजन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन स्क्रीन4,5,,6,7 में इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान की जासके। जबकि मोटे तौर पर सफल, पुनः संयोजन प्रोटीन आधारित तरीकों की आवश्यकता है कि एक झिल्ली रिसेप्टर के ectodomain एक घुलनशील प्रोटीन के रूप में उत्पादित किया जाना है । इसलिए, यह केवल आम तौर पर प्रोटीन पर लागू होता है जिसमें समीपस्थ बाह्य क्षेत्र (जैसे, एकल-पास प्रकार I, टाइप II, या जीपीआई-लंगर) होता है और आम तौर पर रिसेप्टर परिसरों और झिल्ली प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं होता है जो झिल्ली को कई बार फैलाते हैं।
अभिव्यक्ति क्लोनिंग तकनीकजिसमें पूरक डीएन (सीडीएनए) की एक पुस्तकालय कोशिकाओं में ट्रांस्रेड होती है और एक लाभ के लिए परीक्षण किया जाता है-बाध्यकारी फेनोटाइप का उपयोग एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन8की पहचान करने के लिए भी किया गया है। हाल के वर्षों में क्लोन और अनुक्रमित सीडीएनए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के बड़े संग्रहों की उपलब्धता ने उन तरीकों की सुविधा प्रदान की है जिनमें सीडीएएन एनकोडिंग9सेल सतह रिसेप्टर्स को 9,10की पहचान करने के लिए पुनर्संयोजन प्रोटीन के बंधन के लिए सेल लाइनों की जांच की जाती है । सीडीएनए अतिअभिव्यक्ति आधारित दृष्टिकोण, पुनर्संयोजन प्रोटीन आधारित तरीकों के विपरीत, प्लाज्मा झिल्ली के संदर्भ में बातचीत की पहचान करने की संभावना बर्दाश्त करते हैं। हालांकि, सीडीएनए अभिव्यक्ति का निर्माण करने की सफलता कोशिकाओं की सही ढंग से मुड़ा हुआ रूप में प्रोटीन को ओवरएक्सप्रेस करने की क्षमता पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए अक्सर ट्रांसपोर्टरों, चैपरोन और सही ओलिगोमेरिक असेंबली जैसे सेलुलर सहायक कारकों की आवश्यकता होती है। इसलिए एक भी सीडीएनए को स्थानांतरित करना सेल सतह अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है।
सीडीएनए निर्माण या पुनः संयोजन प्रोटीन जांच का उपयोग कर स्क्रीनिंग तकनीक संसाधन-गहन हैं और सीडीएनए या पुनः संयोजन प्रोटीन पुस्तकालयों के बड़े संग्रह की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से डिजाइन किए गए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित तरीकों का उपयोग हाल ही में एक्स्ट्रासेलुलर इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए किया गया है जिन्हें बड़े पुस्तकालयों की असेंबली की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, इन तकनीकों को कोशिका सतह के रासायनिक हेरफेर की आवश्यकता होती है, जो कोशिकाओं की सतह पर मौजूद अणुओं की जैव रासायनिक प्रकृति को बदल सकती है और वर्तमान में केवल ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन11,,12द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत के लिए लागू होती है। वर्तमान में उपलब्ध तरीकों के बहुमत भी प्रोटीन के बीच बातचीत पर भारी ध्यान केंद्रित करते हुए मोटे तौर पर झिल्ली माइक्रोवातावरण से योगदान की अनदेखी, जैसे ग्लाइकान, लिपिड, और कोलेस्ट्रॉल के रूप में अणुओं सहित ।
CRISPR आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग कर अत्यधिक कुशल bialleleic लक्ष्यीकरण के हाल के विकास के एक ही पूल में परिभाषित जीन की कमी कोशिकाओं के जीनोम पैमाने पर पुस्तकालयों सक्षम है कि एक व्यवस्थित और निष्पक्ष तरीके से जांच की जा सकती है विभिन्न संदर्भों में शामिल सेलुलर घटकों की पहचान, सेलुलर सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को विच्छेदन करने, दवाओं, विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों के प्रतिरोध को प्रदान करने वाले क्षोभ की पहचान और एंटीबॉडी13,,14,,15,,16की विशिष्टता निर्धारित करना शामिल है। यहां, हम एक जीनोम-स्केल CRISPR-आधारित नॉकआउट सेल स्क्रीनिंग परख का वर्णन करते हैं जो वर्तमान जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के लिए एक विकल्प प्रदान करता है ताकि एक्स्ट्रासेलुलर रिसेप्टर-लिगाऔर इंटरैक्शन की पहचान की जा सके। आनुवंशिक स्क्रीन द्वारा झिल्ली रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत की पहचान करने का यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है जिनकी व्यक्तिगत लिगांड पर केंद्रित रुचि है क्योंकि यह सीडीएनए या पुनः संयोजन प्रोटीन के बड़े पुस्तकालयों को संकलित करने की आवश्यकता से बचता है।
इस परख में तीन प्रमुख कदम होते हैं: 1) अत्यधिक शौकीन चावला पुनः संयोजन प्रोटीन बाध्यकारी जांच जिसमें ब्याज के रिसेप्टर के बाह्य क्षेत्रों का उत्पादन किया जाता है और फ्लोरेसेंस-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री आधारित बाध्यकारी परखों में उपयोग किया जाता है; 2) बाध्यकारी परखों का उपयोग एक सेल लाइन की पहचान करने के लिए किया जाता है जो पुनः संयोजन प्रोटीन जांच के इंटरैक्शन पार्टनर को व्यक्त करता है; 3) कोशिका रेखा का एक Cas9-व्यक्त संस्करण जो ब्याज के प्रोटीन के साथ बातचीत करता है और जीनोम-स्केल CRISPR/Cas9-आधारित नॉकआउट स्क्रीन का प्रदर्शन किया जाता है(चित्रा 1)। इस आनुवंशिक स्क्रीन में, सेल लाइनों के लिए एक पुनः संयोजन प्रोटीन के बाध्यकारी एक औसत दर्जे का फेनोटाइप के रूप में प्रयोग किया जाता है जिसमें नॉकआउट पुस्तकालय के भीतर कोशिकाओं है कि जांच को बांधने की क्षमता खो दिया है फ्लोरेसेंस आधारित सक्रिय सेल छंटाई (FACS) और जीन है कि अनुक्रमण द्वारा पहचाने गए बाध्यकारी फेनोटाइप के नुकसान का कारण का उपयोग कर हल कर रहे हैं । सिद्धांत रूप में, शौकीन चावला जांच बाध्यकारी और इसके सेल सतह प्रदर्शन के लिए आवश्यक उन लोगों के लिए जिंमेदार रिसेप्टर encoding जीन की पहचान कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल के पहले चरण में झिल्ली से बंधे रिसेप्टर्स के एक्टोडोमेन का प्रतिनिधित्व करने वाले शौकीन चावला पुनः संयोजन प्रोटीन जांच का उत्पादन शामिल है। इन रिसेप्टर्स को अक्सर अपने बाह्य बाध्यकारी कार्यों को बनाए रखने के लिए जाना जाता है जब उनके एक्टोडोमेन को पुनः संयोजन घुलनशील प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाता है। ब्याज के प्रोटीन के लिए, घुलनशील पुनः संयोजन प्रोटीन किसी भी प्रारूप में किसी भी उपयुक्त यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित किया जा सकता है बशर्ते कि इसे बाध्यकारी avidity में वृद्धि के लिए ओलिगोमेराइज्ड किया जा सके, और इसमें ऐसे टैग शामिल हैं जिनका उपयोग फ्लोरेसेंस-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित बाध्यकारी परखों (जैसे, फ्लैग-टैग, बायोटिन-टैग) में किया जा सकता है। HEK293 प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर झिल्ली रिसेप्टर्स के घुलनशील ectodomains के उत्पादन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, साथ ही विभिन्न मल्टीमराइजेशन तकनीकों और प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों पेंटामेरिक प्रोटीन और मोनोमेरिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए निर्माण पहले1,,17वर्णित किया गया है । यहां प्रोटोकॉल एक फ्लोरोक्रोम (जैसे, फाइकोरिथ्रिन, या पीई) के लिए एक प्रकार का स्ट्रेप्टाविजिन के लिए उन्हें संयुग्मित करके मोनोमेरिक बायोटिनेटेड प्रोटीन से फ्लोरोसेंट शौकीन चावला जांच पैदा करने के लिए कदमों का वर्णन करेगा, जिसका उपयोग सीधे सेल-आधारित बाध्यकारी रूपों में किया जा सकता है और इसका पता लगाने के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है। जीनोम-स्केल स्क्रीन प्रदर्शन के लिए सामान्य प्रोटोकॉल पहले ही20,,21वर्णित किए गए हैं, इस प्रकार प्रोटोकॉल मुख्य रूप से मानव V1 (“Yusa”) पुस्तकालय18का उपयोग करCRISPR/Cas9 नॉकआउट स्क्रीनिंग सिस्टम का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री आधारित पुनः संयोजन प्रोटीन बाध्यकारी स्क्रीन प्रदर्शन की बारीकियों पर ध्यान केंद्रित करता है ।
सेलुलर मान्यता में शामिल सेलुलर घटकों को एन्कोडिंग करने वाले जीन की पहचान करने के लिए एक CRISPR आधारित स्क्रीनिंग रणनीति का वर्णन किया गया है । CRISPR सक्रियण का उपयोग करने वाला एक समान दृष्टिकोण बड़े प्रोटीन पुस्तकालयों कोउत्पन्नकरने की आवश्यकता के बिना पुनः संयोजन प्रोटीन के सीधे बातचीत रिसेप्टर्स की पहचान करने के लिए एक आनुवंशिक विकल्प भी प्रदान करता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह सतह के अणुओं द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत पर लागू होता है जो मूल रूप से कोशिका पर प्रदर्शित होते हैं और रिसेप्टर्स की अतिअभिव्यक्ति पर निर्भर नहीं करते हैं, जो रिसेप्टर की बाध्यकारी शौकीनता को प्रभावित कर सकते हैं। अन्य तरीकों के विपरीत, इसलिए, यह तकनीक रिसेप्टर्स की जैव रासायनिक प्रकृति या सेल जीव विज्ञान के बारे में कोई अनुमान नहीं लगाती है और प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करती है जो आम तौर पर जैव रासायनिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके अध्ययन करना मुश्किल होता है, जैसे कि बहुत बड़े प्रोटीन, या जो झिल्ली को कई बार पार करते हैं या अन्य प्रोटीन के साथ जटिल बनाते हैं, और प्रोटीन के अलावा अन्य अणु, ग्लाइकोडाइड, और फोलिफाइड और फोलिफाइड। विधि के जीनोम-स्केल प्रकृति को देखते हुए, इस दृष्टिकोण में न केवल रिसेप्टर की पहचान करने का लाभ है बल्कि अतिरिक्त सेलुलर घटक भी हैं जो बाध्यकारी घटना के लिए आवश्यक हैं, जिससे रिसेप्टर के सेल जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है।
इस विधि की प्रमुख सीमाओं में से एक जब इसका उपयोग करने के लिए एक अनाथ प्रोटीन के रिसेप्टर की पहचान करने के लिए प्रारंभिक आवश्यकता है पहले एक सेल लाइन है कि प्रोटीन के लिए बांध की पहचान है । यह हमेशा आसान नहीं होता है और एक सेल लाइन की पहचान करना जो एक बाध्यकारी फेनोटाइप प्रदर्शित करता है जो आनुवंशिक स्क्रीन के लिए भी स्वीकार्य है, इस परख को तैनात करने के लिए समय-सीमित कदम हो सकता है। कुछ सेल लाइनें दूसरों की तुलना में अधिक प्रोटीन के लिए बांध करते हैं । यह प्रोटीन के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जो एचएस को बांधते हैं, क्योंकि ये प्रोटीन किसी भी सेल लाइन से बांधते हैं जो एचएस साइड चेन प्रदर्शित करता है, चाहे मूल बाध्यकारी संदर्भ कुछ भी हो। इसके अतिरिक्त, हमने देखा है कि कोशिका लाइनों में सिंडेकान (यानी, एचएस वाले प्रोटेओग्लिकन) के अपरेगुलेशन से एचएस-बाइंडिंग प्रोटीन26की बाध्यकारी वृद्धि होती है। स्क्रीनिंग के लिए सेल लाइन का चयन करते समय इसे ध्यान में रखना एक कारक हो सकता है। हालांकि, यह भी ध्यान दें कि एचएस के योजक बाध्यकारी एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है महत्वपूर्ण है । इसका मतलब यह है कि यदि बाध्यकारी मनाया जाता है, तो यह संभव है कि यह पूरी तरह से एचएस द्वारा मध्यस्थता की जाए क्योंकि इस परख में एचएस द्वारा मध्यस्थता की गई बाध्यकारी मध्यस्थता19के बजाय योजक है। ऐसे परिदृश्य में, वर्णित हेपरिन अवरुद्ध दृष्टिकोण पूर्ण आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने की आवश्यकता के बिना ऐसे व्यवहारों की पहचान कर सकता है।
सेल लाइनों को चुनने के लिए एक उपयोगी संसाधन सेल मॉडल पासपोर्ट है, जिसमें ~ 1,000 कैंसर सेल लाइनों27के लिए जीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और संस्कृति स्थिति की जानकारी शामिल है। जैविक संदर्भ के आधार पर, कोशिकाओं को उनकी अभिव्यक्ति प्रोफाइल के आधार पर चुना जा सकता है। सेल लाइनों के चयन में सहायता करने के लिए, हमने सेल मॉडल पासपोर्ट में ~ 1,000 सेल लाइनों को ~ 1,500 प्रीनोटेटेड ह्यूमन सेल सरफेस ग्लाइकोप्रोटीन28 (सप्लीमेंट्री फिगर 2;विकास की स्थिति के साथ प्रत्येक सेल लाइन के लिए क्लस्टर जानकारी पूरक तालिका 2में प्रदान की जाती है) की अभिव्यक्ति के अनुसार संकुल मॉडल पासपोर्ट में ~ 1,000 सेल लाइनों को संकुल किया। अज्ञात फ़ंक्शन के साथ प्रोटीन के बंधन का परीक्षण करते समय, रिसेप्टर्स की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करने की संभावना बढ़ाने के लिए प्रत्येक क्लस्टर से प्रतिनिधि सेल लाइनों के एक पैनल का चयन करना उपयोगी है। एक विकल्प को देखते हुए, सेल लाइनों का चयन करने की सिफारिश की जाती है जो संस्कृति के लिए आसान हैं और ट्रांसड्यू करना आसान है। चूंकि इन सेल लाइनों का उपयोग जीनोम-स्केल स्क्रीनिंग में किया जाएगा, इसलिए यह बेहतर है कि उन्हें बड़ी मात्रा में आसानी से उगाया जा सकता है और लेंटिवायरल ट्रांसड्यूक्शन के लिए स्वतंत्र हैं, क्योंकि यह बाद के चरणों में CRISPR आधारित आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए sgRNA के वितरण के लिए सबसे अधिक उपलब्ध विधि है ।
आम तौर पर, फेनोटाइप चयन एक ही प्रकार में किए जाते हैं। हालांकि, यह नियंत्रण की तुलना में दाग कोशिका आबादी की चमक से निर्धारित होता है। चयन के पुनरावृत्ति दौर परिदृश्यों के लिए अपनाए जा सकते हैं जिनमें वांछित फेनोटाइप का सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम होता है, या जब स्क्रीन का उद्देश्य उन म्यूटेंट की पहचान करना है जिनके पास मजबूत फेनोटाइप होते हैं। जब FACS आधारित स्क्रीन के लिए एक पुनरावृत्ति चयन दृष्टिकोण का उपयोग कर, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि छंटाई प्रक्रिया सेल मौत का कारण बन सकता है, मुख्य रूप से सॉर्टर के सरासर बल के कारण । इस प्रकार, छंटाई के अगले दौर में सभी एकत्र कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व नहीं किया जाएगा।
पुस्तकालय जटिलता सफल आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन में एक बहुत महत्वपूर्ण कारक है, विशेष रूप से नकारात्मक चयन स्क्रीन के लिए, क्योंकि इन में कमी की सीमा केवल शुरू पुस्तकालय में मौजूद था क्या करने के लिए परिणामों की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । नकारात्मक चयन स्क्रीन के लिए, 500-1,000 एक्स जटिलता के पुस्तकालयों को बनाए रखना आम बात है। सकारात्मक चयन स्क्रीन, हालांकि, पुस्तकालय के आकार के लिए अधिक मजबूत हैं, क्योंकि ऐसी स्क्रीन में केवल एक विशेष फेनोटाइप के लिए कम संख्या में म्यूटेंट चुने जाने की उम्मीद है। इसलिए, यहां वर्णित सकारात्मक चयन स्क्रीन में, स्क्रीन की गुणवत्ता से समझौता किए बिना पुस्तकालय के आकार को 50-100x जटिलता तक कम किया जा सकता है। इसके अलावा, इन स्क्रीन में किसी दिए गए दिन पर किसी दिए गए सेल लाइन के लिए नियंत्रण पुस्तकालय का उपयोग करना भी संभव है क्योंकि उस दिए गए सेल लाइन के लिए दिन में हल किए गए सभी नमूनों के लिए “सामान्य नियंत्रण” है। इससे उन नियंत्रण पुस्तकालयों की संख्या में कमी आएगी, जिन्हें उत्पादित और अनुक्रमित करने की आवश्यकता है ।
इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार जीन है कि इन विट्रो सेल विकास के लिए आवश्यक है की पहचान करने में नुकसान के समारोह स्क्रीन की सीमाएं है । स्क्रीन के समय इस संबंध में महत्वपूर्ण है, के रूप में अब उत्परिवर्ती कोशिकाओं संस्कृति में रखा जाता है, उच्च संभावना है कि आवश्यक जीन में उत्परिवर्तन के साथ कोशिकाओं को अव्यवहार्य हो जाते है और अब उत्परिवर्ती पुस्तकालय में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । हाल ही में 300 से अधिक सेल लाइनों में परियोजना स्कोर पहल के एक भाग के रूप में प्रदर्शन आनुवंशिक स्क्रीन से पता चलता है कि KEGG-एनोटेटेड प्रोटीन स्राव और एन ग्लाइकोसिलेशन मार्ग में कई जीन अक्सर सेल लाइनों(अनुपूरक चित्रा 3)29के एक नंबर के लिए आवश्यक होने के रूप में पहचाने जाते हैं । यदि सेलुलर मान्यता प्रक्रिया के संदर्भ में प्रसार और व्यवहार्यता के लिए आवश्यक जीन के प्रभाव की जांच की जानी है तो स्क्रीन डिजाइन करते समय इस पर ध्यान दिया जा सकता है । इस मामले में, शुरुआती टाइमपॉइंट (जैसे, दिन 9 पोस्टट्रांसड्यूक्शन) पर स्क्रीन करना आम तौर पर उपयुक्त होगा। हालांकि, यदि दृष्टिकोण का उपयोग सामान्य सेलुलर रास्तों के बजाय मजबूत आकार प्रभावों के साथ कुछ लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जाता है, तो बाद के समय बिंदु (जैसे, दिन 15-16 पोस्टट्रांसड्यूक्शन) पर स्क्रीन करना उचित हो सकता है।
स्क्रीनिंग से परिणाम बहुत मजबूत हैं; आठ रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन बाध्यकारी स्क्रीन अतीत में प्रदर्शन में, सेल सरफेस रिसेप्टर हर मामले में शीर्ष हिट19था . इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय इंटरैक्शन पार्टनर की पहचान करने के लिए, इसलिए रिसेप्टर और सतह पर इसकी प्रस्तुति में योगदान देने वाले कारकों को उच्च सांख्यिकीय आत्मविश्वास के साथ पहचाना जाना चाहिए। एक बार स्क्रीन का प्रदर्शन किया जाता है और एक हिट को एक ही एसआरएनए नॉकआउट का उपयोग करके मान्य किया जाता है, तो एवेक्सिस4 जैसे मौजूदा जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग करके और सतह प्लाज्मोन अनुनाद का उपयोग करके शुद्ध प्रोटीन के प्रत्यक्ष स्थिर बंधन का उपयोग करके आगे अनुवर्ती प्रदर्शन किया जा सकता है। यहां वर्णित दृष्टिकोण सभी प्रोटीन के लिए लागू होता है जिसके लिए घुलनशील पुनः संयोजन बाध्यकारी जांच उत्पन्न करना संभव है।
सारांश में, यह सेल सतह प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता बातचीत की पहचान करने के लिए एक जीनोम-स्केल CRISPR नॉकआउट दृष्टिकोण है। यह विधि आम तौर पर विभिन्न जैविक संदर्भों की एक विस्तृत श्रृंखला में सेल सतह मान्यता के लिए आवश्यक सेलुलर रास्तों की पहचान करने के लिए लागू होती है, जिसमें जीव की अपनी कोशिकाओं (जैसे, तंत्रिका और प्रतिरक्षा त्मक मान्यता) के साथ-साथ मेजबान कोशिकाओं और रोगजनक प्रोटीन के बीच भी शामिल है। यह विधि रिसेप्टर पहचान के लिए डिज़ाइन किए गए जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के लिए एक आनुवंशिक विकल्प प्रदान करती है, और क्योंकि इसमें बायोकेमिकल प्रकृति या रिसेप्टर्स के सेल जीव विज्ञान के बारे में किसी पूर्व मान्यताओं की आवश्यकता नहीं होती है, इसमें पूरी तरह से अप्रत्याशित खोजों को बनाने की अपार क्षमता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को जीजेएमडब्ल्यू को दिए गए वेलकम ट्रस्ट ग्रांट नंबर 206194 ने सपोर्ट किया। हम साइटोमेट्री कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं: मधुमक्खी लिंग एनजी, जेनिफर ग्राहम, सैम थॉम्पसन, और क्रिस्टोफर हॉल FACS के साथ मदद के लिए ।
Anti-mouse alkaline phosphatase | Sigma | A4656 | |
Blasticidin | Chem-Cruz | SC-204655 | |
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit | Qiagen | 13362 | |
BSA | Sigma | A9647-100G | |
Diethanolamine | Sigma | 398179 | |
DMEM | Gibco | 31966-021 | |
Dneasy Blood and Tissue kit | Qiagen | 69504 | |
DynaMag-96 Side Magnet | Invitrogen | 12331D | |
HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | |
Heparin | Sigma | H4784-1G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa | KK2602 | |
Lipofectamine LTX with PLUS reagent | Invitrogen | 15338100 | |
MoFlo XDP cell sorter | BD | ||
Ni2+-NTA agarose beads | Jena Bioscience | AC-501-25 | |
OPTI-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
OX-68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 1040-506 | |
PD-10 desalting columns | GE healthcare | 17085101 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume | Qiagen | 34964 | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 3115879001 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix | NEB | M0494L | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
SCFA filter | Nalgene | 190-2545 | |
Sony Cell sorter | Sony | ||
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) | Beckman | A63881 | |
Streptavidin-coated microtitre plates | Nalgene | 734-1284 | |
Streptavidin-PE | Biolegend | 405204 |