Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imagens multiespectrais de fluorescência em tecidos parafina-fixados em parafina (FFPE) permitem a detecção de múltiplos marcadores em uma única amostra de tecido que pode fornecer informações sobre coexpressão de antígeno e distribuição espacial dos marcadores. No entanto, a falta de anticorpos adequados para tecidos formalin-fixos pode restringir a natureza dos marcadores que podem ser detectados. Além disso, o método de coloração é demorado. Aqui descrevemos um método rápido para realizar imagens de fluorescência multiespectral em tecidos congelados. O método inclui as combinações de fluoróforos utilizadas, etapas detalhadas para a coloração de camundongos e tecidos congelados humanos e os procedimentos de varredura, aquisição e análise. Para análise de coloração, é utilizado um sistema de imagem multiespectral multiespectral semiautomatizado disponível comercialmente. Através deste método, até seis marcadores diferentes foram manchados e detectados em uma única seção de tecido congelado. O software de análise de aprendizado de máquina pode fenótipo células que podem ser usadas para análise quantitativa. O método descrito aqui para tecidos congelados é útil para a detecção de marcadores que não podem ser detectados em tecidos FFPE ou para os quais os anticorpos não estão disponíveis para os tecidos FFPE.
Introdução
Os recentes avanços em técnicas de imagem microscópica melhoraram significativamente nosso conhecimento e compreensão dos processos biológicos e estados de doenças. In situ detecção de proteínas em tecidos via imunohistoquímica cromogênica (IHC) é realizada rotineiramente na patologia. No entanto, a detecção de múltiplos marcadores usando a coloração cromogênica do IHC está desafiando1 e métodos mais novos para usar abordagens de coloração multiplex imunofluorescência (mIF), onde vários marcadores biológicos são rotulados em uma única amostra de tecido, estão sendo desenvolvidos. A detecção de múltiplos marcadores biológicos é útil, pois as inf....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os tecidos tumorais de camundongos e hlf1623 foram obtidos em nosso laboratório. O tecido de amígdalas humanas foi comprado de um vendedor comercial. Os detalhes estão fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Incorporação de tecidos
- Incorpore tecido fresco na solução OCT (temperatura de corte ideal) e congele o snap usando gelo seco ou nitrogênio líquido.
- Armazene tecidos a -80 °C.
2. Criosecção
- Corte seções de 8 μm em um criostato com temperaturas fixadas em -25 °C.
NOTA: A espessura da seção preferida pode ser ajustada....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Detecção de marcadores manchados únicos em seções congeladas do baço
Como o sistema de imagem semi-automatizado usa um sistema de filtro de cristal líquido (LCTF) que permite uma gama mais ampla de detecção de comprimento de onda25, e como não foram realizadas etapas de amplificação de sinal aqui, primeiro otimizamos a detecção de nossos anticorpos conjugados primários para cada marcador no microscópio. Um exemplo é mostrado na Figura 1,onde cada m.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os tecidos congelados têm sido amplamente utilizados para a imagem mIF para detectar tradicionalmente três a quatro marcadores31 em um tecido usando o método direto e indireto32. No método direto, os anticorpos são conjugados a corantes fluorescativos ou pontos quânticos33 para rotular o tecido, enquanto no método indireto, um anticorpo primário não conjugado é usado para rotular o tecido seguido por um anticorpo secundário conjugado com fluoroforme .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
A orientação de imagem e análise foi fornecida pelo Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core da Universidade de Illinois em Chicago, criado com o apoio do escritório do Vice-Chanceler para Pesquisa. O trabalho foi apoiado pelo NIH/NCI RO1CA191317 ao CLP, pelo NIH/NIAMS (subvenção da SBDRC 1P30AR075049-01) ao Dr. A. Paller, e pelo apoio do Centro De Câncer Integral Robert H. Lurie ao Núcleo de Avaliação de Imunoterapia da Universidade Northwestern.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetona (grau histológico) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixação de tecidos |
| Alexa Fluor 488 anti-camundongo CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; anticorpo conjugado primário |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humano CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; anticorpo conjugado primário |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Anticorpo conjugado primário |
| Alexa Fluor 594 anti-CD3 humano | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; anticorpo conjugado primário |
| Alexa Fluor 594 anti-camundongo CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; anticorpo conjugado primário |
| Alexa Fluor 647 anti-CD8a humano | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; anticorpo |
| conjugado primárioAlexa Fluor 647 anti-rato CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; anticorpo conjugado primário |
| Alexa Fluor 647 anti-rato CD4 | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; anticorpo conjugado primário |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Tecidos congelados de camundongos usados para treinamento multiespectral |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Lâminas de reidratação e lavagem |
| Solução DAPI | BD Biosciences | 564907 | Mancha de ácido nucleico |
| Lâminas carregadas de vidro branco de diamante | DOT Scientific | DW7590W | Seções de tecido aderentes |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x (sem Ca e Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Lavagem e diluente |
| Lamínulas de vedação de ouro | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protegendo tecidos corados |
| Amígdala Normal Humana OCT bloco de tecido congelado | AMSBio | AMS6023 | Tecido humano congelado usado para coloração multiespectral |
| Soro humano 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Bloqueio e diluente para tecidos humanos |
| inForm | Akoya Biosciences | Versão 2.4.1 | Software de aprendizado de máquina |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-humano CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; anticorpo conjugado primário |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; anticorpo conjugado primário |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Versão 1.0.8 | Software de varredura de lâminas inteiras |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Meio |
| de montagemCriostato de pesquisa | Leica Biosystems | CM3050 S | Seccionamento de tecidos |
| Superbloco 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Bloqueio de tecidos de camundongos |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Incorporação de tecidos |
| Vectra 3.0 Sistema automatizado de imagem de patologia quantitativa, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Imagem multiespectral semiautomatizada sistema |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Versão 3.0.5 | Software para operar microscópio |
Referências
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
