Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées
Summary
Ici, nous présentons une méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons à une cellule ainsi qu’un protocole qui couple l’utilisation d’embryons dégelés et l’électroporation pour la génération efficace de souris génétiquement modifiées.
Abstract
L’utilisation de souris génétiquement modifiées (GM) est devenue cruciale pour comprendre la fonction génétique et déchiffrer les mécanismes sous-jacents des maladies humaines. Le système CRISPR/Cas9 permet aux chercheurs de modifier le génome avec une efficacité, une fidélité et une simplicité sans précédent. Exploitant cette technologie, les chercheurs sont à la recherche d’un protocole rapide, efficace et facile pour générer des souris GM. Ici, nous introduisons une méthode améliorée pour la cryoconservation des embryons à une cellule qui conduit à un taux de développement plus élevé des embryons gongés. En le combinant avec des conditions d’électroporation optimisées, ce protocole permet la génération de souris knock-in et knock-in avec une efficacité élevée et de faibles taux de mosaïque dans un court laps de temps. De plus, nous montrons une explication étape par étape de notre protocole optimisé, couvrant la préparation des réactifs CRISPR, la fécondation in vitro, la cryoconservation et le dégel des embryons à une cellule, l’électroporation des réactifs CRISPR, la génération de souris et le génotypage des fondateurs. Grâce à ce protocole, les chercheurs devraient être en mesure de préparer les souris GM avec une facilité, une vitesse et une efficacité inégalées.
Introduction
Le système de répétitions palindromiques courtes et interpatiales groupées régulièrement interpatial (CRISPR)/CRISPR-associé à la protéine 9 (Cas9) est une percée scientifique qui apporte une modification ciblée sans précédent dans le génome1. Le système CRISPR/Cas9 est composé de protéines Cas9 et d’ARN guide (ARN) avec deux composants moléculaires : un ARN CRISPR (crRNA) spécifique à la cible et un ARN CRISPR (tracrRNA) transactivant2 . Un ARN dirige la protéine Cas9 vers le locus spécifique du génome, 20 nucléotides complémentaires au crRNA et adjacents au motif adjacent au protoespacer (PAM). La protéine Cas9 se lie à la séquence cible et induit des pauses à double brin (DSB) qui sont réparées soit par l’assemblage fin non-homologous sujet aux erreurs (NHEJ) ou la réparation à haute fidélité dirigée par homologie (HDR)3,4,5. Le NHEJ conduit à des insertions ou / et des suppressions (indels), et donc à la perte de gène de la fonction quand une séquence de codage est ciblée. Le HDR conduit à l’édition précise du génome en présence d’un modèle de réparation contenant des séquences d’homologie3,4,5. Le NHEJ et le HDR ont été exploités pour générer des souris knock-in et knock-in, respectivement.
Alors que le système CRISPR/Cas9 a nettement accéléré la génération de souris GM avec une efficacité et une fidélité exceptionnelles, les scientifiques qui appliquent ces méthodes rencontrent souvent des défis techniques. Tout d’abord, les protocoles conventionnels nécessitent une microinjection pour l’introduction des outils d’édition CRISPR dans le pronucléus des œufs fécondés6,7. Cette technique prend beaucoup de temps et nécessite généralement une formation approfondie. Ainsi, plusieurs groupes ont remplacé la microinjection par électroporation8,9,10,11,12,13. Cependant, dans les protocoles d’électroporation précoces des embryons frais ont été employés pour l’électroporation. Cela a causé un autre problème, parce que la préparation d’embryons frais avant chaque expérience est difficile14.
Récemment, nous et d’autres avons combiné l’utilisation d’embryons décongelés par le gel et l’électroporation pour l’édition du génome, ce qui facilite la génération de souris GM15,16. Ce protocole permet aux chercheurs qui n’ont pas de compétences avancées en matière de manipulation d’embryons de générer rapidement des modèles animaux de maladies humaines avec une grande efficacité. Le protocole réduit également considérablement les défis pratiques dans la génération de souris GM, telles que l’hétérogénéité génétique dans les fondateurs16. Pour surmonter le mosaïsme, nous effectuons l’électroporation des réactifs CRISPR dans les 1 h après le dégel de l’embryon pour nous assurer que l’édition se produit avant la première réplication du génome. Une autre amélioration comprend l’utilisation de la protéine Cas9 au lieu de Cas9 mRNA pour réduire le mosaïsme indésirable17. En outre, nous avons développé une méthode optimale pour la cryoconservation d’embryon à cellule unique qui augmente le taux de développement au stade16à deux cellules : l’utilisation du sérum bovin fœtal (FBS) améliore considérablement la survie des ovocytes dégelés après la fécondation, peut-être par le même mécanisme qui rend les ovocytes non fécondés dégelés plusrésistants 18.
Nous présentons ici un protocole complet pour la génération de souris GM utilisant des embryons gongés, y compris la méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons C57BL/6J à une cellule. Il comprend 1) conception d’ARN, préparation et assemblage de réactifs CRISPR; 2) FIV, cryoconservation et décongélation d’embryons à une cellule; 3) Électroporation des réactifs CRISPR en embryons décongelés par le gel; 4) Transfert d’embryon dans l’oviducte des souris femelles pseudo-enceintes ; et 5) Analyse de génotypage et de séquence des animaux fondateurs de F0.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit permet la génération de souris GM avec une efficacité élevée et de faibles taux de mosaïque(tableau 1). Il permet aux chercheurs sans compétences avancées en manipulation d’embryons de créer facilement des souris mutantes parce qu’il tire parti des progrès les plus récents et les plus utiles dans les technologies d’ingénierie de la reproduction et d’édition du génome : CRISPR/Cas9 ribonucleorotein (RNP) et électroporation en embryons décongelés par le gel. Ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Hitomi Sawada et Elizabeth Garcia pour les soins aux animaux. Ce travail a été soutenu par KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 et 16K01946) et Hokugin Research Grant (à H.N.), et Jichi Medical University Young Investigator Award (à H.U.). La Fondation de bourses Otsuka Toshimi a appuyé M.D.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
Referências
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Biologia do Desenvolvimento. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genética. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Biologia do Desenvolvimento. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengenharia. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
