השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.
Abstract
השימוש בעכברים שעברו שינוי גנטי (GM) הפך לקריטי להבנת תפקוד הגנים ופענוח המנגנונים הבסיסיים של מחלות אנושיות. CRISPR/Cas9 מערכת מאפשרת לחוקרים לשנות את הגנום עם יעילות חסרת תקדים, נאמנות, ופשטות. רתימת טכנולוגיה זו, חוקרים מחפשים פרוטוקול מהיר, יעיל, קל ליצירת עכברים GM. כאן אנו מציגים שיטה משופרת עבור הקפאת הסתייגות של עוברי תא אחד המוביל לשיעור התפתחותי גבוה יותר של העוברים הקפאת ההקפאה. על ידי שילוב זה עם תנאי אלקטרופורציה אופטימיזציה, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של הסתרה ועכברים לנקוש עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך בתוך זמן קצר. יתר על כן, אנו מראים צעד אחר צעד הסבר על הפרוטוקול הממוטב שלנו, כיסוי CRISPR הכנה מגיב, הפריה חוץ גופית, הקפאה והפשרה של עוברי תא אחד, אלקטרופורציה של ריאגנטים CRISPR, העכבר הדור, ו-הקלדה של המייסדים. באמצעות פרוטוקול זה, החוקרים צריכים להיות מסוגלים להכין עכברים GM עם קלות, מהירות ויעילות ללא תחרות.
Introduction
האשכולות מקובצים באופן קבוע במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR)/קריספר-חלבון משויך 9 (Cas9) מערכת היא פריצת דרך מדעית המספקת שינוי ממוקד חסר תקדים בגנום1. מערכת CRISPR/Cas9 מורכב Cas9 חלבון מדריך RNA (gRNA) עם שני מרכיבים מולקולריים: מטרה ספציפית CRISPR RNA (crRNA) ו-מפעיל הפעלת CRISPR RNA (tracrRNA)2 . GRNA מפנה את חלבון Cas9 למיקום מסוים בגנום, 20 נוקלאוטידים משלימים crRNA, ובצמוד המוטיב הסמוך מוטיב (פאם). חלבון Cas9 נקשר לרצף היעד וגורם הפסקות כפול הגדיל (dsbs) כי הם תוקנו על-ידי מועדים שגיאה שאינם הומוולוגיים סוף הצטרפות (nhej) או בנאמנות גבוהה הומולוגיה תיקון מכוון (HDR)3,4,5. NHEJ מוביל הוספות או/ו מחיקות (indels), ולכן לאובדן גנטי של הפונקציה כאשר רצף קידוד ממוקד. HDR מוביל לעריכת הגנום מדויק בנוכחות תבנית תיקון המכיל רצפים הומולוגיה3,4,5. NHEJ ו HDR כבר לרתום כדי ליצור נוקאאוט ועכברים לנקוש, בהתאמה.
בעוד מערכת CRISPR/Cas9 האיץ במידה ניכרת את הדור של עכברים GM עם יעילות ונאמנות מצטיינים, מדענים המחילים שיטות אלה נתקלים לעתים קרובות אתגרים טכניים. ראשית, פרוטוקולים קונבנציונליים דורשים מיקרוהזרקה להצגת כלי העריכה של crispr לתוך הבאוקלינוס של ביצים מופרות6,7. טכניקה זו גוזלת זמן ובדרך כלל דורש הכשרה נרחבת. כך, מספר קבוצות החליפו מיקרוהזרקה באמצעות אלקטרופורציה8,9,10,11,12,13. עם זאת, בפרוטוקולים אלקטרופורציה מוקדם שימשו עוברים טריים עבור אלקטרופורציה. זה גרם בעיה נוספת, כי הכנת עוברים טריים לפני כל ניסוי הוא קשה14.
לאחרונה אנחנו ואחרים שילבו את השימוש של עוברי הקפאת העוברים ואלקטרופורציה עבור עריכת הגנום, אשר מקל על הדור של GM עכברים15,16. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ללא כישורי מניפולציה מתקדמים העובר ליצור במהירות מודלים של בעלי חיים של מחלות אדם עם יעילות גבוהה. הפרוטוקול גם מפחית באופן משמעותי את האתגרים המעשיים ביצירת עכברים GM, כגון טרוגניות גנטית במייסדים16. כדי להתגבר על הפסיפס, אנו מבצעים את אלקטרופורציה של ריאגנטים CRISPR בתוך 1 h לאחר העובר החוצה כדי להבטיח כי העריכה מתרחשת לפני השכפול הראשון של הגנום. שיפור נוסף כולל את השימוש בחלבון Cas9 במקום Cas9 mRNA להפחתת פסיפס בלתי רצוי17. יתר על כן, פיתחנו שיטה אופטימלית עבור החלפת תא אחד העובר באופן המגביר את השיעור ההתפתחותי של שני תאים בשלב16: שימוש בסרום של שור העוברי (fbs) משפרת בצורה דרמטית את ההישרדות של הקפאת הקפאה oocytes לאחר הפריה, אולי על ידי18אותו מנגנון שעושה הקפאה מופרית בלתי מופרות יותר
כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור הדור של עכברי מג באמצעות עוברים הקפאת ההקפאה, כולל שיטה ששונתה עבור הקפאה של עוברי תא אחד C57BL/6J. זה כולל 1) עיצוב gRNA, קריספלאר הכנה מגיב והרכבה; 2) הפריה חוץ גופית, הקפאה, והתרסה של עוברי תא אחד; 3) אלקטרופורציה של הריאגנטים של CRISPR לתוך עוברים המופשרים; 4) העברה העובר לתוך תעלת ההטלה של עכברים pseudopregnant נשיים; ו-5) בדיקות הגנוזות ורצף של חיות מייסד F0.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר מאפשר דור של עכברים GM עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך (שולחן 1). זה מאפשר לחוקרים ללא מניפולציה מתקדמת מיומנויות העובר כדי ליצור עכברים מוטציה בקלות כי זה מנצל את ההתקדמות האחרונה ושימושי ביותר הן הנדסת הרבייה והגנום עריכת טכנולוגיות: crispr/Cas9 ribonucleoprotein (rnp) ו אלק?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מבקשים להודות לחיטומי סוראדה. ואליזבת גרסיה לטיפול בחיות עבודה זו היתה נתמכת על ידי KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 ו 16H06276) ו Hokugin מחקר גרנט (ל ח), ו Jichi רפואי האוניברסיטה הצעירה פרס החוקר הצעיר (כדי H.U.). קרן מלגות אוטסקה טושימי נתמכת md
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
Referências
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Biologia do Desenvolvimento. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genética. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Biologia do Desenvolvimento. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengenharia. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
