Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati
Summary
Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l’uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.
Abstract
L’uso di topi geneticamente modificati (GM) è diventato cruciale per comprendere la funzione genica e decifrare i meccanismi alla base delle malattie umane. Il sistema CRISPR/Cas9 consente ai ricercatori di modificare il genoma con efficienza, fedeltà e semplicità senza precedenti. Sfruttando questa tecnologia, i ricercatori sono alla ricerca di un protocollo rapido, efficiente e facile per la generazione di topi GM. Qui introduciamo un metodo migliorato per la crioconservazione degli embrioni unicellulari che porta ad un più alto tasso di sviluppo degli embrioni congelato. Combinandolo con condizioni di elettroporazione ottimizzate, questo protocollo consente la generazione di topi knockout e knock-in con alta efficienza e bassi tassi di mosaico in breve tempo. Inoltre, mostriamo una spiegazione passo-passo del nostro protocollo ottimizzato, che copre la preparazione del reagente CRISPR, la fecondazione in vitro, la crioconservazione e lo scongelamento degli embrioni unicellulari, l’elettroporazione dei reagenti CRISPR, la generazione di topi e la genotipizzazione dei fondatori. Utilizzando questo protocollo, i ricercatori dovrebbero essere in grado di preparare i topi GM con facilità, velocità ed efficienza senza pari.
Introduction
Il sistema di proteina palindromica corta (CRISPR)/proteina 9 (Cas9) associata a cluster regolarmente interspazioe è una svolta scientifica che fornisce una modifica mirata senza precedenti nel genoma1. Il sistema CRISPR/Cas9 è composto da proteine Cas9 e guidaRNA (gRNA) con due componenti molecolari: un RNA CRISPR (crRNA) specifico del bersaglio e un RNA CRISPR (tracrRNA)2 che attiva la transattivazione. Un gRNA indirizza la proteina Cas9 al locus specifico nel genoma, 20 nucleotidi complementari al crRNA e adiacenti al motivo adiacente al protospaziale adiacente (PAM). La proteina Cas9 si lega alla sequenza bersaglio e induce interruzioni a doppio filamento (DSB) che vengono riparate da un’estremità non omologa soggetta a errori (NHEJ) o da riparazioni ad alta fedeltà (HDR)3,4,5. Il NHEJ porta a inserimenti o /e delezioni (indels), e quindi alla perdita genica di funzione quando una sequenza di codifica è mirata. L’HDR porta ad una precisa modifica del genoma in presenza di un modello di riparazione contenente sequenze homologia3,4,5. La NHEJ e l’HDR sono stati sfruttati per generare topi knockout e knock-in, rispettivamente.
Mentre il sistema CRISPR/Cas9 ha notevolmente accelerato la generazione di topi GM con eccezionale efficacia e fedeltà, gli scienziati che applicano questi metodi spesso incontrano sfide tecniche. In primo luogo, i protocolli convenzionali richiedono la microiniezione per introdurre gli strumenti di editing CRISPR nel pronucle delle uova fecondate6,7. Questa tecnica richiede molto tempo e di solito richiede un’ampia formazione. Così, diversi gruppi hanno sostituito la microiniezione con elettroporazione8,9,10,11,12,13. Tuttavia, nei primi protocolli di elettroporazione sono stati utilizzati embrioni freschi per l’elettroporazione. Ciò ha causato un altro problema, perché la preparazione di embrioni freschi prima di ogni esperimento è difficile14.
Recentemente noi e altri abbiamo combinato l’uso di embrioni congelati ed elettroporazione per l’editing del genoma, che facilita la generazione di topi GM15,16. Questo protocollo consente ai ricercatori che non hanno competenze avanzate di manipolazione degli embrioni di generare rapidamente modelli animali di malattie umane con alta efficienza. Il protocollo riduce anche significativamente le sfide pratiche nella generazione di topi genetici, come l’eterogeneità genetica nei fondatori16. Per superare il mosaicismo, eseguiamo l’elettroporrazione dei reagenti CRISPR entro 1 h dopo lo scongelamento dell’embrione per garantire che l’editing avvenga prima della prima replicazione del genoma. Un altro miglioramento include l’uso della proteina Cas9 al posto dell’mRNA Cas9 per ridurre il mosaicismo indesiderabile17. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo ottimale per la crioconservazione degli embrioni a una cellula che aumenta il tasso di sviluppo allo stadio a due cellule16: l’uso del siero bovino fetale (FBS) migliora notevolmente la sopravvivenza degli ovociti congelati dopo la fecondazione, forse con lo stesso meccanismo che rende gli ovociti congelati non fecondati più resilienti18.
Qui presentiamo un protocollo completo per la generazione di topi geneticamente modificati utilizzando embrioni con congelamento scongelato, tra cui il metodo modificato per la crioconservazione degli embrioni C57BL/6J a una cellula. Esso comprende 1) progettazione gRNA, preparazione e assemblaggio del reagente CRISPR; 2) fecondazione in vitro, crioconservazione e scongelamento di embrioni unicellulari; 3) Elettroporazione dei reagenti CRISPR in embrioni con congelamento; 4) Trasferimento dell’embrione nell’ovidotto di topi femmine pseudopregnanti; e 5) Genotipizzazione e analisi di sequenza degli animali fondatori F0.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto consente la generazione di topi GM ad alta efficienza e bassi tassi di mosaico (Tabella 1). Consente ai ricercatori privi di avanzate capacità di manipolazione degli embrioni di creare facilmente topi mutanti perché sfruttano i progressi più recenti e più utili nelle tecnologie di ingegneria riproduttiva e di editing del genoma: ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 (RNP) ed elettroporazione in embrioni concongelamento. Questi progressi hanno facilitato e accelerato la generazione de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Hitomi Sawada ed Elizabeth Garcia per la cura degli animali. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 e 16K01946) e Hokugin Research Grant (a H.N.), e dal Jichi Medical University Young Investigator Award (per H.U.). La Otsuka Toshimi Scholarship Foundation ha sostenuto M.D.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
Referências
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Biologia do Desenvolvimento. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genética. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Biologia do Desenvolvimento. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengenharia. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
