Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados
Summary
Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.
Abstract
O uso de camundongos geneticamente modificados (GM) tornou-se crucial para entender a função genética e decifrar os mecanismos subjacentes das doenças humanas. O sistema CRISPR/Cas9 permite que os pesquisadores modifiquem o genoma com eficiência, fidelidade e simplicidade sem precedentes. Aproveitando essa tecnologia, os pesquisadores estão buscando um protocolo rápido, eficiente e fácil para a geração de ratos GM. Aqui introduzimos um método aprimorado para criopreservação de embriões unicelulares que leva a uma maior taxa de desenvolvimento dos embriões congelados. Ao combiná-lo com condições de eletroporação otimizadas, este protocolo permite a geração de ratos nocaute e knock-in com alta eficiência e baixas taxas de mosaico em um curto espaço de tempo. Além disso, mostramos uma explicação passo a passo do nosso protocolo otimizado, abrangendo preparação de reagente CRISPR, fertilização in vitro, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares, eletroporização de reagentes CRISPR, geração de mouses e genotipagem dos fundadores. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de preparar ratos GM com facilidade, velocidade e eficiência incomparáveis.
Introduction
O sistema de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) é um avanço científico que proporciona uma modificação direcionada sem precedentes no genoma1. O sistema CRISPR/Cas9 é composto por proteína Cas9 e rna guia (gRNA) com dois componentes moleculares: um RNA CRISPR específico para alvo (crRNA) e um RNA CRISPR transativador (tracrNA)2 . Um gRNA direciona a proteína Cas9 para o lócus específico no genoma, 20 nucleotídeos complementares ao crRNA, e adjacentes ao protoespaço adjacente (PAM). A proteína Cas9 liga-se à seqüência de destino e induz quebras de fios duplos (DSBs) que são reparadas por uma junção final não homologo (NHEJ) propensa a erros ou reparação dirigida à homologia de alta fidelidade (HDR)3,,4,5. O NHEJ leva a inserções ou/e exclusões (indels) e, portanto, à perda genética da função quando uma seqüência de codificação é direcionada. O HDR leva à edição precisa do genoma na presença de um modelo de reparo contendo seqüências de homologia3,4,5. O NHEJ e o HDR foram aproveitados para gerar nocaute e knock-in, respectivamente.
Embora o sistema CRISPR/Cas9 tenha acelerado significativamente a geração de ratos GM com excelente eficácia e fidelidade, cientistas que aplicam esses métodos frequentemente encontram desafios técnicos. Em primeiro lugar, os protocolos convencionais requerem microinjeção para introduzir as ferramentas de edição CRISPR no pronúcleo de ovos fertilizados6,7. Essa técnica é demorada e geralmente requer treinamento extensivo. Assim, vários grupos substituíram a microinjeção por eletroporação88,9,10,,11,12,13. No entanto, nos primeiros protocolos de eletroporação foram utilizados embriões frescos para eletroporação. Isso causou outro problema, pois preparar embriões frescos antes de cada experimento é difícil14.
Recentemente, nós e outros combinamos o uso de embriões congelados e eletroporação para edição de genomas, o que facilita a geração de camundongos GM15,16. Este protocolo permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões gerem rapidamente modelos animais de doenças humanas com alta eficiência. O protocolo também reduz significativamente os desafios práticos na geração de camundongos GM, como a heterogeneidade genética nos fundadores16. Para superar o mosaico, realizamos a eletroporação dos reagentes CRISPR dentro de 1h após o descongelamento do embrião para garantir que a edição ocorra antes da primeira replicação do genoma. Outra melhoria inclui o uso da proteína Cas9 em vez de Cas9 mRNA para reduzir o mosaico indesejável17. Além disso, desenvolvemos um método ideal para criopreservação de embriões unicelulares que aumenta a taxa de desenvolvimento para o estágio16de duas células : o uso de soro bovino fetal (FBS) melhora drasticamente a sobrevivência de oócitos congelados após a fertilização, talvez pelo mesmo mecanismo que torna os oócitos não fertilizados congelados mais resistentes18.
Aqui apresentamos um protocolo abrangente para a geração de camundongos GM usando embriões congelados, incluindo o método modificado para criopreservação de embriões C57BL/6J de células únicas. Inclui 1) design gRNA, preparação e montagem de reagentes CRISPR; 2) FIV, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares; 3) Eletroporização dos reagentes CRISPR em embriões congelados; 4) Transferência de embriões para o oviduto de camundongos pseudogestantes; e 5) Genotipagem e análise de seqüência dos animais fundadores do F0.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito permite a geração de camundongos GM com alta eficiência e baixas taxas de mosaico(Tabela 1). Ele permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões criem camundongos mutantes facilmente porque ele aproveita os mais recentes e mais úteis avanços em tecnologias de engenharia reprodutiva e edição de genomas: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) e eletroporção em embriões congelados. Esses avanços facilitaram e aceleraram a geração dos ratos GM…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer hitomi Sawada e Elizabeth Garcia pelo cuidado com os animais. Este trabalho foi apoiado por KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 e 16K01946) e Hokugin Research Grant (para H.N.), e Jichi Medical University Young Investigator Award (para H.U.). A Fundação de Bolsas Otsuka Toshimi apoiou o M.D.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
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