מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה
Summary
מטרת שיטה זו היא לקבוע את צפיפות CR1 ב אריתרופוציטים של כל נושא על ידי השוואת עם שלושה נושאים שצפיפות הCR1 של erythrocyte ידועה. השיטה משתמשת cy, לאחר כתמים חיסוני של הנבדקים ‘ אריתרופוציטים על ידי נוגדן אנטי CR1 שבטיים מצמידים למערכת מוגברת באמצעות phycoארימתרין (PE).
Abstract
CR1 (CD35, משלים מסוג הקולטן 1 עבור C3b/C4b) הוא הממברנה מולקולרית משקל גבוה גליקופרוטאין של כ 200 kda כי שולטת הפעלה משלימים, הובלות מתחמי החיסון, ומשתתפת תגובות החיסונית ומוראלית הסלולר. CR1 נמצא על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כולל אריתרופוציטים, ומוצגים פולימריות באורך, מבנה (Knops, או KN, קבוצת דם), וצפיפות. הצפיפות הממוצעת של CR1 לאריתרופואריציט (CR1/E) היא 500 מולקולות לכל אריתרופואריציט. צפיפות זו משתנה מאדם אחד למשנהו (100 – 1200 CR1/E) ומתוך אריתרופואריציט אחד למשנהו באותו אדם. אנו מציגים כאן השיטה החזקה cy, למדוד את הצפיפות של CR1/E, כולל בנושאים המבטא צפיפות נמוכה, בעזרת מערכת חיסונית הגברה. שיטה זו אפשרה לנו להראות את הורדת הביטוי CR1 אריתרופוציטים במחלות כגון מחלת אלצהיימר (AD), זאבת מערכתית שושנה (מיקרו), איידס, או מלריה.
Introduction
CR1 (סוג קולטן משלים 1, CD35) הוא 200 kda הטרנסקרום גליקופרוטאין להציג על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כגון אריתרופוציטים1, B לימפוציטים2, תאים monocytic, כמה תאים T, תאים דנדריטים הזקיקים3, העובר אסטרוציטים4, ו-podocytes מדומה5. CR1 מתערב עם ליגידיים C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, יחידת משנה של רכיב המשלים הראשון, C1q10 ו mbl (mannan-כריכה לקטין)11 מעכב את ההפעלה של המשלים והוא מעורב התגובה החיסונית הוואתית והסלולר.
בפרימטים, כולל בני אדם, אריתרופויציט CR1 מעורב בהובלת מתחמי החיסון לכבד ולטחול, כדי לטהר את הדם ולמנוע את ההצטברות שלהם ברקמות פגיעות כגון העור או הכליות12,13,14. תופעה זו של הדבקה חיסונית בין מכלולי החיסון ו אריתרופוציטים תלוי במספר של CR1 מולקולות15. בבני אדם, הצפיפות הממוצעת של CR1/E היא רק 500 (כלומר, 500 מולקולות של CR1 לכל אריתרופואריציט). צפיפות זו משתנה מאדם אחד למשנהו (100 – 1200 CR1/E) ומתוך אריתרופואריציט אחד למשנהו באותו אדם. אנשים מסוימים של “null” פנוטיפ פחות מ 20 CR1/E16.
את הצפיפות של CR1/E מוסדר על ידי שני שיתוף השכל אללים מקושר מוטציה נקודה ב אינטרון 27 של קידוד הגן עבור CR1 * 117,18. מוטציה זו מייצרת אתר הגבלה נוסף עבור האנזים HindIII. שברי ההגבלה שהתקבלו לאחר העיכול עם hindiii במקרה זה הם 7.4 kb עבור אלל מקושר ביטוי חזק של CR1 (H: high אלל) ו 6.9 kb עבור אלל מקושר CR1 ביטוי נמוך (L: אלל נמוך). קישור זה נמצא בקווקז ובאסיאתים, אך לא באנשים ממוצא אפריקאי19.
רמת הביטוי של אריתרופואריציט CR1 הוא גם מתואם עם נוכחות של נוקלאוטיד הנקודה מוטציות ב אקסון 13 קידוד SCR 10 (I643T) ו ב אקסון 19 קידוד SCR16 (Q981H). הוא גבוה ב homozygous 643I/981Q ונמוך ב homozygous 643I/981Q אנשים20. כך, אנשים “נמוכים” מבטאים סביב 150 CR1/E, “בינוני” אנשים לבטא סביב 500 CR1/E, ו “גבוהה” אנשים מבטאים סביב 1,000 CR1/E.
בנוסף לפולימורפיזם דחיסות זו, CR1 מאופיין בפולימורפיזם אורך התואם לארבעה אלוסוגים של גדלים שונים: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), ו CR1 * 4 (250 kDa)21 ו פולימורפיזם אנטיגניים המתאימים לקבוצת הדם KN22.
אנו מציגים את השיטה שלנו מבוסס על הזרימה cy, נסה לקבוע את צפיפות CR1/E. באמצעות שלושה נושאים שצפיפות CR1/E שלהם ידועה, ביטוי רמת צפיפות נמוכה (180 CR1/E), רמת צפיפות בינונית (646 CR1/E), ורמת צפיפות גבוהה (966 CR1/E), קל למדוד את עוצמת הזריחה הממוצע (MFI) של האריתרופוציטים שלהם או כדוריות הדם האדומות (RBC), או RBC MFI, אחרי אנטי CR1 מכתים באמצעות cytometry זרימה. ניתן להתוות קו סטנדרטי המייצג את MFI כפונקציה של צפיפות CR1/E. מדידת MFI של נושאים שצפיפות ה-CR1/E שלהם אינה ידועה ומשווה אותו לקו סטנדרטי זה, ניתן לקבוע את צפיפות הCR1/E של האנשים. טכניקה זו שימש במשך שנים רבות במעבדה, והוא איפשר לנו לזהות הפחתה בביטוי של אריתרופולוגיה CR1 בפתווגיות רבות כגון זאבת מערכתית מאריטתסוס (הדלקת)23, תסמונת כשל חיסוני נרכש (איידס)24, מלריה25, ומחלת אלצהיימר לאחרונה (AD)26,27. התפתחות התרופות מיקוד CR1 לזוג עם אריתרופוציטים, כמו במקרה של תרופות נגד טרומבוטיים28 דורש הערכה של CR1/E צפיפות, ואת הזמינות של טכניקה איתנה לכמת CR1.
הפרוטוקול שהוצג. פועל בסינגליאט הוא ניתן להתאמה כדי לקבוע את צפיפות CR1/E על אנשים רבים באמצעות ספציפי מסחרית זמין 96 לוחות היטב (ראה לוח חומרים). למטרה זו, קל להתאים את השיטה שלנו לצלחת כל 96. עבור כל דוגמה, השעיית תא של אריתרופוציטים (0.5 x 106– 1 x 106 אריתרופוציטים) מופץ בכל טוב. עבור כל באר, תחילה את הנוגדן העיקרי anti-CR1 מתווסף, אז streptavidin PE, נוגדן אנטי streptavidin משני, ושוב streptavidin PE, באמצעות הדילול זהה לאלה של השיטה שלנו, אבל על ידי התאמת כרכים וכיבוד המידתיות.
דגימות הדם מהנושאים של הטווח ומנושאים שיש לכמת עבור CR1 צריכות להיות מצוירות באותו זמן, מאוחסנות במקרר ב -4 ° c ומטופלות ב -4 ° צ’ (על קרח ו/או במקרר).
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות מסוימות זמינות כדי לקבוע את הצפיפות של אריתרופויציט CR1 (CR1/E). הטכניקות הראשונות ששימשו היו התנוצנות של כדוריות הדם האדומות על ידי anti-CR1 נוגדנים31 ואת היווצרות רוזטות בנוכחות של אריתרופוציטים מצופה עם C3b32. טכניקות אלה בסיסי הוחלפו במהירות על ידי שיטות חיסוני…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי URCACyt, הזרימה cy, בפלטפורמת הטכנית, צוות המחלקה לאימונולוגיה, וצוות המחלקה לרפואה פנימית וגריאטריה, שתרמו למיטוב ולאימות הפרוטוקול. עבודה זו ממומנת על ידי בתי חולים של אוניברסיטת ריימס (גרנט מספר AOL11UF9156).
Materials
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman – type M25 – | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
Referências
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer’s disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer’s Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
