Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Resumo

Descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular para monitorar as mudanças em tempo real na glicolyse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato.

Resumo

O esperma mamífero adquire a capacidade da fecundação no intervalo reprodutivo fêmea em um processo conhecido como a capacitação. Os processos associados à capacitação requerem energia. Ainda há um debate em curso sobre as fontes que geram o ATP que alimenta a motilidade progressiva do esperma, a capacitação, a hiperativação, e a reação acrógrada. Aqui, descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular como uma ferramenta para analisar as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma do rato. Usando h⁺- e O₂- fluoroforres sensíveis, este método permite monitorar a glicolíse e a fosforilação oxidativa em tempo real em espermatozóides não capacitados versus capacitados. Usar este ensaio na presença de diferentes substratos energéticos e/ou ativadores farmacológicos e/ou inibidores pode fornecer insights importantes sobre a contribuição de diferentes vias metabólicas e a interseção entre sinalização de cascatas e metabolismo durante a capacitação do esperma.

Introdução

A aplicação da espectrometria de massa revolucionou o estudo do metabolismo. Perfil metabólico direcionado e rastreamento metabolômico permitem monitoramento preciso das mudanças no metabolismo energético. No entanto, a realização de metabolômica saem com sucesso requer treinamento extensivo, pessoal experiente e espectrômetros de massa caros e altamente sensíveis não prontamente disponíveis para todos os laboratórios. Nos últimos anos, usando um analisador de fluxo extracelular, como o Seahorse XFe96 tem crescido popular como um método substituto para medir as mudanças no metabolismo energético em vários tipos de células^1,

Protocolo

Os espermatozóides são coletados de 8-16 semanas de idade CD-1 ratos machos. Experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Weill Cornell Medicine.

1. Dia antes do ensaio

1. Preparação do cartucho do sensor e do calibrador extracelular do analisador do fluxo
   1. Para hidratar o cartucho do sensor, retire o cartucho do sensor do Kit de Ensaio de Fluxo Extracelular XFe96 e coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de serviço público.
   2. Preencha um reservatório de solução com 25 mL de H₂O com destilação dupla ....

Resultados

Este método usa um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças em tempo real na taxa de glicolíse e oxphos durante a capacitação de espermatozóides do mouse. A figura 4 mostra um experimento exemplar em que o esperma foi capacitado na presença de glicose como o único substrato de energia e 2-DG e antimicina e rotenone como moduladores farmacológicos. O substrato de energia no amortecedor TYH do analisador de fluxo extracelular e os moduladores fa.......

Discussão

A perda de capacitação do esperma na ausência de certos substratos metabólicos ou enzimas metabólicas críticas revelou o metabolismo energético como um fator chave que suporta a fertilização bem sucedida. Um interruptor metabólico durante a ativação celular é um conceito bem estabelecido em outros tipos de células, no entanto, estamos apenas começando a entender como o esperma adapta seu metabolismo à crescente demanda de energia durante a capacitação. Usando um analisador de fluxo extracelular, desenvolvemos uma ferrame.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
fortes
2-desoxi-D-glicose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-isobutil-1-metilxantina	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; preparar uma solução-mãe a 500 mM em DMSO (111,1 mg/ml) e conservar em alíquotas pequenas
Antimicina A	Sigma-Aldrich	A8674	Anta; preparar uma solução-mãe a 5 mM em DMSO (2,7 mg/ml) e conservar em pequenas alíquotas:
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalina A, Lectina de Arachis hypogaea (amendoim)	Sigma-Aldrich	L7381
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Saúde Animal	1169567761	Isoflurano
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutiriladenosina 3',5'-monofosfato cíclico sal de sódio	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Di-hidrogenofosfato de potássio	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Rot; preparar uma solução de estoque de 5 mM em DMSO (2mg/ml) e armazenar em pequenas alíquotas
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-Cloreto de
sódio	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment e materiais
12 10-100 μ L	eppendorf	ES-12-100
Pipeta de 12 canais 50-300 μ L	vwr	613-5257
37 ° C, incubadora não-CO2	vwr	1545
Tubos de cetrífugo de 5 mL	eppendorf	30119380
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL	vwr	76211-286
Centrífuga com adaptador de placa	IEC FL40R		Thermo Scientific
	World Precision	Instruments MOUSEKIT
Microscópio de contraste de fase invertida com objetiva de 40X	Reservatórios de solução Nikon
OctaPool, 25 ml, dividido	Thomas Scientific	1159X93
Reservatórios de solução OctaPool, 25 mL, dividido	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Também vendido como XFe96 FluxPak mini (102601-100) com 6 cartuchos em vez de 18

Kit de dissecação da .