Использование внеклеточного анализатора flux для измерения изменений в гликолизе и окислительной фосфорилации во время емки спермы мыши
Summary
Мы описываем применение внеклеточного анализатора потока для мониторинга изменений гликолиза в режиме реального времени и окислительного фосфорилирования во время конденсации спермы мыши.
Abstract
Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению в женском репродуктивном тракте в процессе, известном как емкости. Процессы, связанные с конденсацией, требуют энергии. Остается продолжающаяся дискуссия об источниках генерации АТФ, который питает прогрессивную подвижность спермы, емкости, гиперактивации и акросома реакции. Здесь мы описываем применение внеклеточного анализатора потока как инструмент для анализа изменений в энергетическом метаболизме во время конденсации спермы мыши. Используя Hq– и O2– чувствительные фторофоры, этот метод позволяет контролировать гликолиз и окислительный фосфорилирование в режиме реального времени в не-конденсированных против емкисперма спермы. Использование этого анализа в присутствии различных энергетических субстратов и/или фармакологических активаторов и/или ингибиторов может дать важное представление о вкладе различных метаболических путей и пересечении сигнальных каскадов и метаболизма во время конденсации спермы.
Introduction
Применение масс-спектрометрии произвело революцию в изучении метаболизма. Целенаправленное метаболическое профилирование и метаболомическое отслеживание позволяют точно контролировать изменения в энергетическом метаболизме. Тем не менее, выполнение метаболомики успешно требует обширной подготовки, опытный персонал, и дорогие, высокочувствительные масс-спектрометры не легко доступны для каждой лаборатории. В последние годы, используя внеклеточный анализатор потока, таких как Seahorse XFe96 стал популярным в качестве суррогатного метода для измерения изменений в энергетическом метаболизме в различных типах клеток1,2,3,4.
Сперма являются узкоспециализированными мотильные клетки; чья задача состоит в том, чтобы доставить отцовский геном к яйцеклетке. Сперматозоиды, покидающие мужской репродуктивный тракт после эякуляции, по-прежнему функционально незрелы и не могут оплодотворить яйцеклетки, потому что они не могут проникнуть в облачения яйцеклеток. Сперма приобретает компетенцию по оплодотворению, поскольку они проходят через женский репродуктивный тракт в процессе созревания, известном как конденсация6,7. Свежеэякуляция сперма или сперма, расчлененные из кауда эпидидимис может быть конденсирован в пробирке путем инкубации в определенных емчечных носителях, содержащих Ca2 “, бикарбонат (HCO3–) или клеточной проницаемой аналоге cAMP (например, dibutyryl-cAMP), принимая холестерин (например, буйный сывороточный альбомин, BSA) и источник энергии (например, глюкоза). Во время емкости, спермаизменить их шаблон подвижности в асимметричный флагельер бить, представляющий режим плавания называется гиперактивации8,9, и они становятся компетентными пройти акросома реакции7, где протеолитических ферментов освобождены, которые переваривают облачения яйцеклеток. Эти процессы требуют энергии, и аналогичные соматические клетки, сперматозоиды генерировать АТФ и других соединений высокой энергии с помощью гликолиза, а также митохондриальный цикл TCA и окислительного фосфорилирования (оксифос)10. Хотя многочисленные исследования показывают, что гликолиз необходим и достаточно для поддержки спермы емчебой11,12,13,14, вклад oxphos менее ясно. В отличие от других типов клеток, где гликолиз физически связан с циклом TCA, сперма сильно разобщена и, как полагают, поддерживает эти процессы в отдельных отсеках флагеллара: средний элемент концентратирует митохондриальную технику, в то время как ключевые ферменты гликолиза, как представляется, ограничены основной частью15,16. Это разобщенности приводит к продолжающейся дискуссии о том, pyruvate производится в основной кусок гликолизом может поддерживать митохондриальный oxphos в середине, и является ли АТФ производства oxphos в середине будет в состоянии рассеять достаточно быстро по длине flagellum для поддержки энергетических потребностей в дистальных частей основной части17,19. Существует также поддержка роли oxphos в емчеобразной сперме. Мало того, что oxphos более энергетически благоприятным, чем гликолиз, генерации 16 раз больше АТФ, чем гликолиз, но средний объем и митохондриальный содержание непосредственно коррелируют с репродуктивной пригодности у млекопитающих видов, которые демонстрируют большую степень конкуренции между мужчинами для товарищей20. Для решения этих вопросов требуются методы изучения относительного вклада гликолиза и оксифоса во время конденсации спермы.
Tourmente et al. применили 24-хорошо внеклеточный анализатор потока, чтобы сравнить энергетический метаболизм тесно связанных видов мышей со значительно отличаемыми параметрами производительности спермы21. Вместо того, чтобы сообщать о базальных значениях ECAR и OCR неконденционной спермы, здесь мы адаптируем их метод с помощью 96-хорошо внеклеточного анализатора потока потока для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме во время емкостя спермы мыши в режиме реального времени. Мы разработали метод, который позволяет одновременно контролировать гликолиз и oxphos в режиме реального времени в сперме с избиением флагеллы в до двенадцати различных экспериментальных условиях путем измерения потока кислорода (O2) и протонов (H)(Рисунок 1A). В связи с разбивкой пировата лактата во время гликолиза и производства CO2 через Цикл TCA, неемные и емкие спермы экструдировать Hв анализ средств, которые обнаруживаются внеклеточного анализатора флюкса через H–чувствительные флюорофоры обездвижены к кончику зонда датчика. Параллельно, O2 потребление окислительного фосфорилирования обнаруживается через O2чувствительных флюорофоров обездвижены к тому же наконечник зонда (Рисунок 1B). Эффективное обнаружение высвобожденных Hи потребляемых O2 требует модифицированного буфера спермы с низкой буферной емкостью без бикарбоната или фенола красного цвета. Таким образом, чтобы вызвать емки при отсутствии бикарбоната, мы приняли использование клеточного аналога cAMP, введенного вместе с широкодиапазонным ингибитором PDE IBMX22. Три дополнительных независимых порта инъекций позволяют впрыски фармакологических активаторов и/или ингибиторов, что облегчает обнаружение в режиме реального времени изменений в клеточном дыхании и скорости гликолиза в связи с экспериментальными манипуляциями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Потеря емкостя спермы при отсутствии определенных метаболических субстратов или критических метаболических ферментов выявила энергетический обмен в качестве ключевого фактора, поддерживающего успешное оплодотворение. Метаболический переключатель во время активации клеток являет…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить поддержку д-ра Лавуазье Рамоса-Эспириту в Центре ресурсов Рокфеллера и спектроскопии.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
Referências
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O’Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
