細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

Summary

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。

Abstract

合成細胞の構築のためのボトムアップアセンブリアプローチは、細胞模倣環境で細胞プロセスを分離し、調査するための効果的なツールです。さらに、無細胞発現系の開発は、タンパク質の産生、転写、翻訳プロセス(DNA→RNA→タンパク質)を制御された方法で再構成する能力を実証し、合成生物学を活用しています。ここでは、コレステロールが豊富な脂質ベースの巨大なユニラメラ小胞(すなわち、安定したリポソーム)の中に強力な細菌リゼートを産生し、カプセル化する、無細胞発現系を調製するためのプロトコル(すなわち、安定リポソーム)を説明する。プロトコルは、活性細菌リセートの生産を含む合成細胞の成分を調製するための方法を説明し、続いて、油中水エマルジョン移動法に基づく合成細胞の詳細なステップバイステップ調製を行う。これらは、タンパク質の異なるタイプを生産するための高い汎用性を持つシンプルで手頃な方法で合成細胞の数百万の生産を容易にします。得られた合成細胞は、単離された環境でのタンパク質/RNA産生および活性を調査し、指示された進化において、また体内での治療タンパク質のオンデマンド生産のための制御薬物送達プラットフォームとして使用することができる。

Introduction

合成細胞は、人工的な細胞様粒子であり、生細胞の1つまたは複数の機能を模倣し、例えば、分裂する能力、膜相互作用を形成し、遺伝コード^{11、2、32,3}に基づいてタンパク質を合成する。無細胞タンパク質合成(CFPS)システムを包み込んだ合成細胞は、DNAテンプレートの変化に伴い様々なタンパク質やRNA配列を産生する能力により、高いモジュール性を有します。タンパク質産生の現在のアプローチに代わる魅力的な代替手段を提示するCFPSシステムは、細胞リ^,セート、精製成分、または合成成分に基づいており、リボソーム、RNAポリメラーゼ、アミノ酸およびエネルギー源(例えば、3-ホスホグリセリン酸およびアデニンリン酸)4、5、6、7、9、9、リソソー^4,5ムなどのタンパク質合成に必要なすべての転写および翻訳機械を含む。^6,7,8,9脂質小胞内のCFPSシステムのカプセル化は、生細胞¹⁰に依存することなく、タンパク質の簡単かつ効率的な生産を可能にする。さらに、このプラットフォームは、天然細胞内で分解し得るペプチドの合成、生きている細胞に毒性のあるタンパク質の産生、および非天然アミノ酸^11、12,12を有するタンパク質を改変することを可能にする。合成細胞は、進化的な視点から細胞の生命を可能にするために必要な最小限の細胞成分を調査する研究目的のモデルとして使用されてきた^11,13。合成細胞は、遺伝的回路の構築と実装、および指向進化^{14、15、1615,16}のモデルとしても使用されてきた。¹⁴他の研究は、天然細胞の生物活性を模倣する合成細胞の能力に焦点を当て、糖尿病患者におけるベータ細胞などの損傷した天然細胞を置き換えることを目指している^17。さらに、これらのCFPSカプセル化合成細胞が種々の治療用タンパク質を産生する能力は、臨床使用¹⁸に組み込まれる可能性を示している。

ここでは、脂質小胞に封入されたCFPSシステムに基づくRNAおよびタンパク質産生合成細胞の産生のためのボトムアップラボスケールプロトコル(図1)について説明する。これは、生体内での治療タンパク質薬のオンサイト生産のための新規薬物送達システムとしての合成細胞プラットフォームの潜在的な使用を示す^19。これまでの研究では、CFPS反応と細胞ライセート調製プロセス^{44、8、208,20}の最適化を調査してきました。また、細胞サイズのリポソーム製剤としては、マイクロ流体およびポリマーベースの液滴安定化法21,22,23など^21,22,、リポソームの脂質組成^{24,25,2625,26}にも異なる手法²⁴が適用されている。²³提示されたプロトコルにおいて、合成細胞は、油中の水中のエマルジョン移動法を用いて製造され、カプセル化プロセスは低温(<4°C)5、10、24、27、28で行われる。^{5,10,24,27,28}これらの穏やかな条件は、分子機械、すなわちリボソームおよびタンパク質^{27、29、3029,30}の生体機能完全性を保持²⁷するために好ましいことが判明している。粒子の脂質組成は、コレステロールと1-パルミトイル-2-オレロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)の両方からなる。第1は、すべての哺乳動物細胞膜に見られ、膜の安定性、剛性および透過性の低下に不可欠であり、後者は哺乳動物リン脂質組成物^11、13,13を模倣する。細胞転写および翻訳分子機械はBL21(DE3)大腸菌(大腸菌)株から抽出され、PAR1219プラスミドで過剰発現するT7 RNAポリメラーゼで形質転換され、CFPSの効力とタンパク質合成を増加させる。このシステムは、診断および治療用タンパク質を産生するために使用されており、インビトロおよびインビボ^19,31,31の最大66 kDaの分子量を有する。以下のプロトコルは、合成細胞系の生産のための簡単かつ効果的な方法を提供し、タンパク質合成に関連する広範な基本的な問題に本質的に対処することができ、また、薬物送達用途に利用することができる。

Protocol

注: 完全な合成セルの生産プロトコルの図を図 1に示します。ユーザーのニーズに応じて、プロトコルのタンパク質発現(セクション3.2)および合成細胞形成(セクション4)部分も独立して(いくつかの適応を伴って)行うことができる。 1. S30-T7のリセートの調製 50 μg/mL アンピシリンを補ったLB-寒天プレート上にpAR1219プラスミドを発現するT7 RNAポ?…

Representative Results

脂質小胞内にBL21大腸菌を用いたS30-T7 CFPSシステムをカプセル化することにより、合成細胞の調製のためのプロトコルを提示する。各段階のイメージを含む準備プロセスの概略説明を図 2に示します。合成細胞調製プロセスの成功は、各段階の適切な性能に依存し、異なるパラメータによって影響を受けます。プロトコルは、特定のタンパク質の生産に対応するよ?…

Discussion

このプロトコルは、大量のタンパク質産生合成細胞を製造するための簡単で手頃な方法を導入しています。アクティブセルの収量は、いくつかの重要なステップに重点を置いて、プロトコルの慎重かつ正確な実行に依存しています。この方法のライセート調製部では、菌体のリセート中に十分な量のタンパク質を得るためには、細胞のリシス前に適切な細菌密度に到達することが不可欠であ?…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.