Levering af modificeret mRNA i en myokardieinfarkt musemodel
Summary
Denne protokol præsenterer en enkel og sammenhængende måde at forbigående upregulate et gen af interesse ved hjælp af modRNA efter myokardieinfarkt i mus.
Abstract
Myokardieinfarkt (MI) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i den vestlige verden. I det seneste årti er genterapi blevet en lovende behandlingsmulighed for hjertesygdomme på grund af dens effektivitet og ekstraordinære terapeutiske virkninger. I et forsøg på at reparere det beskadigede væv post-MI, forskellige undersøgelser har ansat DNA-baseret eller viral genterapi, men har stået over for betydelige forhindringer på grund af den dårlige og ukontrollerede udtryk for de leverede gener, ødem, arytmi, og hjertehypertrofi. Syntetisk modificeret mRNA (modRNA) præsenterer en ny genterapi tilgang, der tilbyder høj, forbigående, sikker, nonimmunogen, og kontrolleret mRNA levering til hjertet væv uden risiko for genomisk integration. På grund af disse bemærkelsesværdige egenskaber kombineret med sin klokkeformede farmakokinetik i hjertet, er modRNA blevet en attraktiv tilgang til behandling af hjertesygdomme. Men for at øge dens effektivitet in vivo, en konsekvent og pålidelig leveringsmetode skal følges. Derfor, at maksimere modRNA levering effektivitet og udbytte konsistens i modRNA brug for in vivo applikationer, en optimeret metode til forberedelse og levering af modRNA intracardiac injektion i en mus MI model præsenteres. Denne protokol vil gøre behandling af modRNA mere tilgængelig for grundforskning og translationel forskning.
Introduction
Genterapi er et kraftfuldt værktøj, der involverer levering af nukleinsyrer til behandling, helbredelse eller forebyggelse af sygdomme hos mennesker. På trods af de fremskridt i den diagnostiske og terapeutiske tilgange til hjertesygdomme, der har været begrænset succes i leveringen af gener i myokardieinfarkt (MI) og hjertesvigt (HF). Så ligetil som processen med genterapi synes, det er en markant kompleks tilgang i betragtning af de mange faktorer, der skal optimeres, før der anvendes en bestemt levering køretøj. Den korrekte leveringsvektor skal være ikke-immunogen, effektiv og stabil inde i den menneskelige krop. Indsatsen på dette område har skabt to typer af leveringssystemer: viral eller ikke-viral. De udbredte virale systemer, herunder genoverførsel med adenovirus, retrovirus, lentivirus eller adeno-associeret virus, har vist en usædvanlig transduktionskapacitet. Men, deres anvendelse i klinikker er begrænset på grund af den stærke immunrespons induceret1, risiko for tumorigenesis2, eller tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer3, som alle fortsat er en stor hindring for bred og effektiv anvendelse af virale vektorer i human genterapi. På den anden side, på trods af deres imponerende udtryk mønster, levering af nøgne plasmid DNA viser en lav transfection effektivitet, mens mRNA overførsel præsenterer høj immunogenicitet og modtagelighed for nedbrydning af RNase4.
Med den omfattende forskning inden for mRNA, modRNA er blevet et attraktivt redskab til levering af gener til hjertet og forskellige andre organer på grund af sine mange fordele i forhold til traditionelle vektorer5. Fuldstændig udskiftning af uridin med naturligt forekommende pseudouridin resulterer i et mere robust og forbigående proteinudtryk med minimal induktion af medfødt immunrespons og risiko for genomisk integration6. Nyligt etablerede protokoller bruger en optimeret mængde anti-reverse cap analog (ARCA), som yderligere forbedrer proteinoversættelsen ved at øge stabiliteten og transabiliteten af den syntetiske mRNA7.
Tidligere rapporter har vist udtryk for forskellige reporter eller funktionelle gener leveret af modRNA i gnaver myokardi efter MI. Med modRNA-applikationer er væsentlige områder af myokardiet, herunder både kardiomyocytter og ikke-kardiocycykardit, blevet transficeret efter hjerteskade8 for at fremkalde angiogenese9,,10,overlevelse af hjerteceller11og kardiomyocytproliferation12. En enkelt administration af modRNA kodet til muteret human follistatin-lignende 1 inducerer spredning af mus voksne cms og øger hjertefunktionen, nedsætter arstørrelse, og øger kapillær tæthed 4 uger efter MI12. En nyere undersøgelse rapporterede forbedret hjertefunktion efter MI med anvendelse af VEGFA modRNA i en svinemodel10.
Således, med den øgede popularitet af modRNA i hjertefeltet, er det vigtigt at udvikle og optimere en protokol for levering af modRNA til hjertet post-MI. Heri er en protokol, der beskriver forberedelse og levering af renset og optimeret modRNA i en biokompatibel citrat-saltvand formulering, der giver robust, stabil protein udtryk uden at stimulere nogen immunrespons. Den metode, der er vist i denne protokol og video viser standard kirurgisk procedure for en mus MI ved permanent ligation af venstre forreste faldende arterie (LAD), efterfulgt af tre site intracardiac injektioner af modRNA. Målet for dette papir er klart at definere en meget præcis og reproducerbar metode til modRNA levering til murine myokardiet for at gøre modRNA ansøgning bredt tilgængelig for hjertegenterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genterapi har vist et enormt potentiale til at fremme behandlingen af hjertesygdomme betydeligt. Men, traditionelle værktøjer ansat i de første kliniske forsøg til behandling af HF har vist begrænset succes og er forbundet med alvorlige bivirkninger. Modificeret RNA præsenterer en nonviral genlevering, der konstant vinder popularitet som et genoverførselsværktøj i hjertet. ModRNA kræver ingen nuklear lokalisering af gener til oversættelse, og giver dermed et effektivt og hurtigt udtryk for proteinet. Da mRNA i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Ann Anu Kurian for hendes hjælp med dette manuskript. Dette arbejde blev finansieret af et kardiologiudstartstilskud til Zangi-laboratoriet og også nih-tilskud R01 HL142768-01
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
Referências
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
