En protokol er beskrevet for in situ perfusion af musen underkroppen, herunder blæren, prostata, kønsorganer, knogle, muskel og fod hud.
Ex vivo perfusion er et vigtigt fysiologisk redskab til at undersøge funktionen af isolerede organer (f.eks. lever, nyrer). På samme tid, på grund af den lille størrelse af museorganer, ex vivo perfusion af knogler, blære, hud, prostata, og reproduktive organer er udfordrende eller ikke muligt. Her rapporterer vi for første gang en in situ lavere krop perfusion kredsløb i mus, der omfatter ovenstående væv, men omgår de vigtigste clearance organer (nyre, lever, og milt). Kredsløbet er etableret ved cannulating abdominal aorta og ringere vena cava over iliaca arterie og vene og ætsende perifere blodkar. Perfusion udføres via en peristaltisk pumpe med perfusatflow vedligeholdt i op til 2 timer. In situ farvning med fluorescerende lectin og Hoechst opløsning bekræftede, at mikrovasculature blev gennemtritueret med succes. Denne musemodel kan være et meget nyttigt redskab til at studere patologiske processer samt mekanismer af lægemiddellevering, migration / metastase af cirkulerende tumorceller i / fra tumoren, og interaktioner af immunsystemet med perfunderede organer og væv.
Isoleret organperfusion blev oprindeligt udviklet til at studere organfysiologi til transplantation1,,2,3, og aktiveret forståelse af funktioner af organer uden indblanding fra andre organsystemer. For eksempel, isolerede nyre og hjerte perfusion var uhyre nyttig i forståelsen af grundlæggende principper for hæmodynamik og virkninger af vasoaktive stoffer, mens leveren perfusion var vigtigt at forstå den metaboliske funktion, herunder lægemiddelmetabolisme i sunde og sygevæv 4,5,6,7. Desuden var perfusionsundersøgelser afgørende for forståelsen af levedygtigheden og funktionen af organer, der er beregnet til transplantation. I Cancer Researchearch, isolerede tumor perfusion er blevet beskrevet af flere grupper ved hjælp af mus, rotte, og frisk resected humane væv8,9. I nogle isolerede tumor perfusion, tumoren blev implanteret i æggestokkene fedt pad til at tvinge væksten af tumor leverer blodkar fra mesenteri arterie10. Jain-gruppen udførte banebrydende undersøgelser ved hjælp af isolerede perfusion af kolon adenocarcinomer at forstå tumor hæmodynamik og metastase8,,11,,12,13. Andre innovative manipuleret ex vivo opsætninger omfatter en 96-godt plade-baseret perfusion enhed til kultur den primære menneskelige myelomatoseceller 14 og en modulær flow kammer for engineering knoglemarvsarkitektur og funktion forskning15.
Ud over fysiologi og patologi undersøgelser, organperfusion er blevet brugt til at studere de grundlæggende principper for lægemiddellevering. Således beskrev en gruppe isoleret rotteekstremitetperfusion og studerede akkumulering af liposomer i implanteredesarkomer 16, mens en anden gruppe udførte dissekeret human nyreperfusion for at studere endotelmålretningen af nanopartikler17. Ternullo et al. brugte en isoleret perfunderet menneskelig hudflap som en nær-til-in vivo hudstof penetration model18.
På trods af disse fremskridt i perfusion af store organer og væv, der har været nogen rapporter om in situ perfusion modeller i mus, der: a) omgå clearance organer såsom lever, milt og nyrer; b) omfatter bækkenorganer, hud, muskler, kønsorganer (hos mænd), blære, prostata og knoglemarv. På grund af disse organers lille størrelse og den leverende vaskulatur har ex vivo-kanylering og etablering af et perfusionskredsløb ikke været muligt. Musen er den vigtigste dyremodel inden for kræft- og immunologiforskning og lægemiddellevering. Evnen til at gennemgå små museorganer ville give interessante spørgsmål vedrørende levering af lægemidler til disse organer, herunder til tumorer implanteret i bækkenet (blære, prostata, æggestok, knoglemarv), der skal besvares, samt undersøgelser af grundlæggende fysiologi og immunologi af sygdomme i disse organer. For at afhjælpe denne mangel udviklede vi et in situ perfusion kredsløb i mus, der potentielt kan undgå vævsskade og er meget bedre egnet til funktionel forskning end isoleret organperfusion.
Det beskrevne kredsløb kan bruges til at sonde forskellige forskningsspørgsmål, for eksempel den rolle, som forskellige serumkomponenter og vævsbarrierer i lægemiddellevering, eller immun-og stamcellehandel. Forskellige lægemiddelleveringssystemer (f.eks. liposomer og nanopartikler) kan føjes til perfusatet for at forstå de fysiologiske og biokemiske faktorers rolle i leveringen. Varigheden af perfusion kan variere, afhængigt af det undersøgte væv, videnskabelige mål, og sammensætningen af perfusat. Vi præs…
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet af NIH tilskud CA194058 til DS, Skaggs School of Pharmacy ADR frø tilskud program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), Projektet for internationalt samarbejde i Jilin-provinsen (nr. 201180414085GH), de grundlæggende forskningsfonde for de centrale universiteter, programmet for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Equipment | |||
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
Materials | |||
19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
Reagents | |||
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |