Создание In Situ закрытого цепи перфузии нижних органов брюшной полости и задних конечностей у мышей
Summary
Протокол описан для in situ перфузии нижней части тела мыши, в том числе мочевого пузыря, простаты, половых органов, кости, мышцы и стопы кожи.
Abstract
Ex vivo перфузии является важным физиологическим инструментом для изучения функции изолированных органов (например, печени, почек). В то же время, из-за небольшого размера органов мыши, ex vivo перфузии кости, мочевого пузыря, кожи, простаты и репродуктивных органов является сложной или неосуществимой. Здесь мы впервые сообщаем о схеме перфузии нижней части тела у мышей, которая включает в себя вышеуказанные ткани, но обходит основные органы очистки (почки, печень и селезенка). Схема устанавливается путем канниелирования брюшной аорты и нижней полой вены над подвздошной артерией и венами и прижигания периферических кровеносных сосудов. Перфузия осуществляется через перистальтический насос с перфузионным потоком, поддерживаемым до 2 ч. На месте окрашивания флуоресцентным лектином и раствором Hoechst подтверждается, что микроваскулатура была успешно пронизана. Эта модель мыши может быть очень полезным инструментом для изучения патологических процессов, а также механизмов доставки лекарств, миграции/метастазирования циркулирующих опухолевых клеток в/из опухоли, а также взаимодействия иммунной системы с переполнимыми органами и тканями.
Introduction
Изолированный орган перфузии был первоначально разработан для изучения физиологии органов для трансплантации1,2,3, и позволило понимание функций органов без вмешательства со стороны других систем организма. Например, изолированная перфузия почек и сердца была чрезвычайно полезна для понимания основных принципов гемодинамики и эффектов вазоактивных агентов, в то время как перфузия печени была важна для понимания метаболической функции, включая метаболизм наркотиков в здоровой и больной ткани4,,5,,6,,7. Кроме того, исследования перфузии имеют решающее значение для понимания жизнеспособности и функции органов, предназначенных для трансплантации. В Cancer Researchearch, изолированные перфузии опухоли была описана несколькими группами с помощью мыши, крысы, и свежестекованные человеческие ткани8,9. В некоторых изолированных перфузии опухоли, опухоль была имплантирована в яичников жира площадку, чтобы заставить рост опухоли, снабжающей кровеносные сосуды из мезентерии артерии10. Группа Jain выполнила новаторские исследования с использованием изолированных перфузии аденокарциномы толстой кишки, чтобы понять опухолевую гемодинамику и метастазы8,,11,,12,13. Другие инновационные инженерии ex vivo установки включают 96-ну пластины на основе перфузии устройства для культуры первичных человеческих множественных клеток миеломы14 и модульной камерой потока для инженерной архитектуры костного мозга и функции исследований15.
В дополнение к исследованиям физиологии и патологии, перфузия органов была использована для изучения основных принципов доставки лекарств. Так, одна группа описала изолированную перфузию конечностей крыс и изучила накопление липосом в имплантированных саркомах16,в то время как другая группа выполнила расчлененную перфузию почек человека для изучения эндотелиального таргетинга наночастиц17. Ternullo et al. использовали изолированный переполох кожи человека как близко к vivo модели проникновения препарата кожи18.
Несмотря на эти достижения в перфузии крупных органов и тканей, не было никаких сообщений о на месте перфузии моделей у мышей, что: а) шунтирование органов очистки, таких как печень, селезенка и почки; б) включают органы малого таза, кожу, мышцы, репродуктивные органы (у мужчин), мочевой пузырь, простату и костный мозг. Из-за небольшого размера этих органов и поставки сосудов, ex vivo каннуляция и создание перфузии цепи не представляется возможным. Мышь является наиболее важной моделью животных в исследованиях рака и иммунологии, а также в доставке лекарств. Способность взлетать маленькие органы мыши позволит ответить на интересные вопросы, касающиеся доставки лекарств в эти органы, в том числе к опухолям, имплантированных в таз (пузырь, простата, яичник, костный мозг), а также исследования фундаментальной физиологии и иммунологии заболеваний этих органов. Для решения этой проблемы мы разработали схему перфузии на мышах, которая потенциально может избежать повреждения тканей и гораздо лучше подходит для функциональных исследований, чем изолированные перфузии органов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанная схема может быть использована для зондирования различных вопросов исследований, например, роли различных компонентов сыворотки и тканевых барьеров в доставке лекарств или торговле иммунной и стволовыми клетками. Различные системы доставки лекарств (например, липосомы и на?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано NIH грант CA194058 DS, Skaggs школа фармации ADR программы субсидирования семян (DS); Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 317771093), Проект международного сотрудничества провинции Цзилинь (No.20180414085Г), Фонд фундаментальных исследований для центральных университетов, Программа для JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
