Um protocolo é descrito para a perfusão in situ do corpo inferior do camundongo, incluindo a bexiga, a próstata, órgãos sexuais, osso, músculo e pele do pé.
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Artigo de método
Estabelecendo in Situ Circuito Fechado Perfusão de Órgãos Abdominais Inferiores e Membros Traseiros em Camundongos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A ex-perfusão é uma importante ferramenta fisiológica para estudar a função de órgãos isolados (por exemplo, fígado, rins). Ao mesmo tempo, devido ao pequeno tamanho de órgãos de camundongos, a perfusão ex vivo de órgãos ósseos, bexiga, pele, próstata e reprodução é desafiadora ou inviável. Aqui, relatamos pela primeira vez um circuito de perfusão do corpo in situ em camundongos que inclui os tecidos acima, mas contorna os principais órgãos de liberação (rim, fígado e baço). O circuito é estabelecido por cannulação da aorta abdominal e veia cava inferior acima da artéria ilíaca e veia e cauterização dos vasos sanguíneos periféricos. A perfusão é realizada através de uma bomba peristáltica com fluxo perfusado mantido por até 2 h. A coloração in situ com lectina fluorescente e solução Hoechst confirmou que a microvasculatura foi perfundida com sucesso. Este modelo de camundongo pode ser uma ferramenta muito útil para estudar processos patológicos, bem como mecanismos de entrega de drogas, migração/metástase de células tumorais circulantes para/a partir do tumor, e interações do sistema imunológico com órgãos e tecidos perfumados.
Introdução
A perfusão isolada de órgãos foi originalmente desenvolvida para estudar a fisiologia de órgãos para transplante1,,2,,3, e possibilitou a compreensão das funções dos órgãos sem interferência de outros sistemas corporais. Por exemplo, a perfusão renal e cardíaca isolada foi imensamente útil na compreensão dos princípios básicos da hemodinâmica e dos efeitos dos agentes vasoativos, enquanto a perfusão hepática foi importante para a compreensão da função metabólica, incluindo o metabolismo medicamentoso no tecido saudável e doente4,,
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Colorado.
1. Pré-aqueça o sistema de perfusão
- Prepare o sistema de perfusão antes da cirurgia iniciando um banho de água circulante de 37 °C para todos os componentes reveses de água (reservatório perfusado, câmara úmida e tampa) como mostrado em uma configuração personalizada na Figura 1A. Certifique-se de que a tubulação está limpa e substitua se necessário. Para limitar o volume perfusado, use uma armadilha de bolhas dentro de uma câmara úmida como o reservatório perfusa....
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Resultados
Montamos um sistema de perfusão de circuito fechado através da canulação da aorta abdominal e da cava vena inferior de camundongos de 8 a 10 semanas de idade, mantendo o volume de tampão de perfusão inferior a 10 mL. A Figura 3A mostra imagens confocais após perfumar tecidos com a solução de Ringer contendo Hoechst 33342 e DyLight 649-lectina. Músculo, medula óssea, testis, bexiga, próstata e pele do pé mostram uma coloração nuclear e vascular eficiente. A Figura 3B
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Discussão
O circuito descrito pode ser usado para sondar várias questões de pesquisa, por exemplo, o papel de diferentes componentes séricos e barreiras teciduais no fornecimento de drogas, ou tráfico de células-tronco e imunes. Diferentes sistemas de entrega de medicamentos (por exemplo, lipossomos e nanopartículas) podem ser adicionados ao perfusato, a fim de entender o papel dos fatores fisiológicos e bioquímicos na entrega. A duração da perfusão pode variar, dependendo do tecido estudado, dos objetivos científicos e da composi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O estudo foi apoiado pela concessão do NIH CA194058 ao DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant nº 31771093), o Projeto de Colaboração Internacional da Província de Jilin (nº 201180414085GH), os Fundos Fundamentais de Pesquisa para as Universidades Centrais, o Programa de Pesquisa Inovadora em Ciência e Tecnologia da JLU (2017TD-27, 2019TD-36).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 3.5x-90x microscópio de zoom estéreo em suporte de lança com luz LED | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Dióxido de carbono, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Microscópio confocal | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Caneta de cauterização estéril descartável com | FIAB | de alta temperaturaF7244 | |
| Armadilha de bolhas de câmara úmida (parte 6 na Figura 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Personalizado como o recipiente perfisate; também permitiu perfusão de pressão constante |
| Tampa da câmara úmida com janela de quartzo (parte 3 na Figura 1) | Harvard Apparatus | 733524 | manter a temperatura da câmara |
| Câmara úmida com trocador de calor de tubo de metal | Harvard Apparatus | 732901 | Câmara úmida com camisa de água com tampa para manter a temperatura do perfusato e do mouse |
| Porta-agulhas Olsen-Hegar com cortadores de sutura | Ferramentas de Belas Ciências (FST) | 125014 | |
| Oxigênio comprimido, | C2649150AE06 | de saúde USP Airgas | |
| Bomba de rolos (parte 4 na Figura 1) | Aparelho Harvard | 730113 | fornecer perfusato à cânula na câmara úmida |
| Servocontrole SCP plugsys F / Perfusão (parte 1 na Figura 1) | Aparelho Harvard | 732806 | controlar a velocidade de purfusão |
| Almofada de silicone Aparelho | |||
| Conjunto de tubos de silicone (setas na Figura 1) | Aparelho Harvard (TYGON) | 733456 | |
| Pinça padrão padrão do aluno | Ferramentas de ciências finas (FST) | 91100-12 | |
| Tesoura cirúrgica | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Tabela para câmara úmida | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (parte 2 na Figura 1) | Harvard Apparatus | 724927 | banho-maria circulante para todos os componentes com camisa de água |
| Torneira de três vias (parte 5 na Figura 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Máquina de anestesia veterinária | Highland | HME109 | |
| Materiais | |||
| 19-G BD Agulha PrecisionGlide | BD | 305186 | Para imobilizar a agulha alada Insyte Autoguard e coçar o osso cortical |
| 4-0 suturas de seda | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 Filtro | de 427401 | Keebomed-Hopemedical | |
| ( 0,2 µ m) | Filtro ThermoFisher | 42225-CA | para 5% BSA-RINGER' S |
| Marcador permanente | Seringa Staedtler | 342-9 | |
| (10 mL) | Seringa Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| (60 mL) | BD | 309653 Filtro para 5% BSA-RINGER' S | |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue (p/v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% formalina tamponada | velleyvet | 36692 | |
| camundongos BALB/c (8-10 semanas de idade) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactato Solução de Ringer | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Albumina de soro bovino | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cola de cianoacrilato | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectina | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Etanol (70% (vol / vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurano | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Fosfato tampolado solução salina | Gibco | 10010023 |
Referências
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).
- Kabagambe, S. K., et al.
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Reimpressões e permissões
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