تحضير العينات البيولوجية للانتواع في درجة حرارة التبريد باستخدام التحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية

Summary

يقدم هذا البروتوكول إجراء مفصلا لإعداد عينات التبريد البيولوجية لتجارب التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية القائمة على السنكروترون. نحن نصف جميع الخطوات المطلوبة لتحسين إعداد العينات والحفظ بالتبريد مع أمثلة على البروتوكول مع خلايا السرطان والعوالق النباتية. توفر هذه الطريقة معيارا عالميا لإعداد العينات بالتبريد.

Abstract

إن دراسة العناصر ذات التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية (XAS) ذات أهمية خاصة عند دراسة دور المعادن في النظم البيولوجية. يعد تحضير العينات إجراء رئيسيا وغالبا ما يكون معقدا ، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية. وعلى الرغم من أن تقنيات انتواع الأشعة السينية تستخدم على نطاق واسع، لم يتم بعد نشر أي بروتوكول مفصل لمستخدمي هذه التقنية. علاوة على ذلك ، فإن تعديل الحالة الكيميائية أمر مثير للقلق ، ويوصى بالتقنيات القائمة على التبريد لتحليل العينات البيولوجية في حالتها المائية شبه الأصلية لتوفير أقصى قدر من الحفاظ على السلامة الكيميائية للخلايا أو الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكول إعداد خلوي يعتمد على العينات المحفوظة بالتبريد. ويتضح ذلك في التألق عالي الدقة للطاقة الذي تم الكشف عنه دراسة طيفية لامتصاص الأشعة السينية للسيلينيوم في الخلايا السرطانية ودراسة للحديد في العوالق النباتية. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع عينات بيولوجية أخرى وتقنيات الأشعة السينية الأخرى التي يمكن أن تتضرر من التشعيع.

Introduction

تتطلب دراسة التحولات الحيوية الخلوية للعناصر الأساسية أو السامة تقنيات انتواع ذات حساسية عالية ويجب أن تقلل إلى أدنى حد من خطوات إعداد العينات التي غالبا ما تكون عرضة لتعديل الأنواع الكيميائية.

من المعروف أن العناصر الفسيولوجية مثل السيلينيوم والحديد يصعب تحديدها بشكل خاص بسبب كيمياءها المعقدة ، والثبات المختلفة لأنواع السيلينيوم أو الحديد ، وتركيزها المنخفض في نطاق جزء في المليون (مغ / كغ) أو حتى دون جزء في المليون. وبالتالي ، فإن دراسة انتواع هذه العناصر بواسطة XAS يمكن أن تكون صعبة للغاية. السنكروترون XAS وخاصة التألق عالي الدقة للطاقة المكتشف XAS (HERFD-XAS) ، والذي يسمح بنسبة إشارة إلى خلفية منخفضة للغاية¹ ، متوفرة في مصادر السنكروترون لتحديد العناصر المخففة للغاية في المصفوفات البيولوجية المعقدة ^2,3. يمكن إجراء قياسات التألق XAS التقليدية باستخدام كاشف الحالة الصلبة المحلولة للطاقة (SSD) مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 150-250 eV ، على خط شعاع CRG-FAME في المرفق الأوروبي لإشعاع السنكروترون (ESRF)⁴ ، في حين تحتاج قياسات HERFD-XAS إلى مطياف محلل البلورات (CAS) ، مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 1-3 eV ، على خط شعاع CRG-FAME-UHD في ESRF² . يتم تمييز الفوتونات الفلورية فيما يتعلق بطاقتها مع العمليات الإلكترونية أو البصرية على التوالي.

يعد تحضير العينة بالتبريد ضروريا للحفاظ على الهياكل والحفاظ على السلامة الكيميائية التركيبية ، مما يسمح بالتحليل بالقرب من الحالة البيولوجية الأصلية⁵. وعلاوة على ذلك، فإن التحليلات التي تجرى في درجات حرارة مبردة تصل إلى 10 كلفن باستخدام التبريد المبرد بالهيليوم السائل (LN₂)، تسمح للضرر الإشعاعي بالتباطؤ وتحافظ على الانتواع الأولي ل XAS. على الرغم من أن بعض المراجعات حول تقنيات XAS المطبقة على العينات البيولوجية تفيد بضرورة إعداد وتحليل العينات في الظروف المبردة (على سبيل المثال ، Sarret et ^al.6 و Porcaro et ^al.7) ، إلا أن أيا منها لا يصف بوضوح البروتوكول التفصيلي ذي الصلة. في هذا المنشور ، يتم وصف طريقة للتحضير المبرد للخلايا السرطانية والكائنات الحية الدقيقة للعوالق لانتواع HERFD-XAS ل Se⁸ و Fe⁹ في درجة حرارة مبردة.

تتطلب الممارسة الجيدة لإعداد العينات والبيئة أثناء قياسات التحليل الطيفي XAS الحديثة 1) إعدادا ؛ 2) إجراء تحليل يحد من آثار الضرر الإشعاعي قدر الإمكان ؛ و 3) عينة (أو مرجع مركب نموذجي) متجانسة قدر الإمكان فيما يتعلق بحجم شعاع فوتونات الأشعة السينية. يؤخذ العنصر الأول في الاعتبار عن طريق إجراء عملية الاستحواذ عند درجة حرارة منخفضة ، باستخدام كريوستات الهيليوم السائل. يتم التعامل مع البند الثاني من خلال تنفيذ كل عملية اقتناء على مساحة جديدة من العينة عن طريق تحريكها فيما يتعلق بالشعاع. وأخيرا، وبالنظر إلى الشرط الثالث، فإن العينات (الكريات) والمراجع (المساحيق) مشروطة في كريات سائبة مضغوطة من أجل الحد من المساميات وعدم التجانس قدر الإمكان، وتجنب الخشونة فيما يتعلق بحجم الحزمة على سطح العينة الذي تم فحصه بالأشعة السينية. نوضح كيف يتعامل البروتوكول مع كل هذه النقاط.

استخدمنا خط خلايا البروستاتا البشرية PC-3 (إمكانات نقيلي عالية) وخط خلية المبيض OVCAR-3 (الذي يمثل ما يصل إلى 70٪ من جميع حالات سرطان المبيض) للتحقيق في الخصائص المضادة للتكاثر تجاه الخلايا السرطانية لجسيمات السيلينيوم النانوية (Se-NPs) ، و Phaeodactylum tricornutum diatom كنوع نموذجي للتحقيق في عزل الحديد في العوالق النباتية.

Protocol

1. إعداد الكريات البشرية PC-3 و OVCAR-3 الخلايا السرطانية لانتواع السيلينيوم ملاحظة: البروتوكول التالي مقتبس من Weekley et al.10. يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء استزراع الخلايا بموجب شروط وقيود السلامة الأحيائية من المستوى 2 ، باستخدام تقنيات التعقيم. عد الخلايا باست…

Representative Results

كانت الأهداف الرئيسية لهذه المستحضرات هي التحقيق في التفاعل بين جسيمات السيلينيوم النانوية (Se-NPs) والخلايا السرطانية ، وربط الحديد وعزله في العوالق النباتية. أطياف HERFD-XANES من السيلينيوم في الحالة الأولية (BSA Se-NPs) وفي الخلايا المحتضنة في وسط غذائي (BSA Se-NPs بعد حضانة 24 ساعة) موضحة…

Discussion

تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة الشكل الكيميائي للسيلينيوم والحديد في العينات البيولوجية عن طريق التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية. وهو يركز على إعداد وتخزين العينات البيولوجية والمركبات المرجعية بالتبريد ، وكذلك على قياسات HERFD-XAS.

إعداد التبريد وتخزينه
ي…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C