Denne protokol præsenterer en detaljeret procedure til fremstilling af biologiske kryoprøveudler til synkrotronbaserede røntgenabsorptionsspektroskopieksperimenter. Vi beskriver alle de trin, der kræves for at optimere prøveforberedelse og kryopræservering med eksempler på protokollen med kræft- og fytoplanktonceller. Denne metode tilvejebringer en universel standard for prøve kryo-forberedelse.
Undersøgelsen af elementer med røntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) er af særlig interesse, når man studerer metallernes rolle i biologiske systemer. Prøveforberedelse er en vigtig og ofte kompleks procedure, især for biologiske prøver. Selvom røntgenspecieringsteknikker er meget udbredt, er der endnu ikke udbredt nogen detaljeret protokol for brugere af teknikken. Endvidere er kemisk tilstandsmodifikation bekymrende, og kryobaserede teknikker anbefales til at analysere de biologiske prøver i deres næsten indfødte hydrerede tilstand for at give den maksimale bevarelse af cellernes eller vævets kemiske integritet. Her foreslår vi en cellulær forberedelsesprotokol baseret på kryo-konserverede prøver. Det er påvist i en højenergiopløsning fluorescens detekteret røntgenabsorptionsspektroskopi undersøgelse af selen i kræftceller og en undersøgelse af jern i fytoplankton. Denne protokol kan bruges sammen med andre biologiske prøver og andre røntgenteknikker, der kan blive beskadiget af bestråling.
Undersøgelsen af de cellulære biotransformationer af essentielle eller toksiske elementer kræver specieringsteknikker med høj følsomhed og bør minimere prøveforberedelsestrin, der ofte er tilbøjelige til modifikation af kemiske arter.
Fysiologiske elementer som selen og jern er kendt for at være særligt vanskelige at specificere på grund af deres komplekse kemi, forskellige stabiliteter af selen- eller jernarterne og deres lave koncentration i ppm (mg / kg) eller endda sub-ppm-området. Således kan undersøgelsen af specieringen af disse elementer af XAS være ekstremt udfordrende. Synkrotron XAS og især fluorescens med høj energiopløsning detekteret XAS (HERFD-XAS), som tillader et meget lavt signal-til-baggrund-forhold1, er tilgængelige ved synkrotronkilder for at specificere stærkt fortyndede elementer i komplekse biologiske matricer 2,3. Konventionelle fluorescens-XAS-målinger kan udføres ved hjælp af en energiopløst solid state-detektor (SSD) med en energibåndbredde ~ 150-250 eV på CRG-FAME-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, mens HERFD-XAS-målinger har brug for et krystalanalysatorspektrometer (CAS) med en energibåndbredde ~ 1-3 eV på CRG-FAME-UHD-strålelinjen ved ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineres med hensyn til deres energi med henholdsvis elektroniske eller optiske processer.
Prøve-kryo-præparatet er afgørende for at bevare strukturer og opretholde sammensætningsmæssig kemisk integritet, hvilket muliggør analyse tæt på den biologiske oprindelige tilstand5. Desuden tillader analyser udført ved kryogene temperaturer så lave som 10 K ved hjælp af flydende heliumkrogen køling (LN2), strålingsskader at bremse og bevare elementær speciering for XAS. Selvom nogle anmeldelser af XAS-teknikker anvendt på biologiske prøver rapporterer nødvendigheden af at forberede og analysere prøver under kryogene forhold (f.eks. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen af dem klart den relaterede detaljerede protokol. I denne publikation beskrives en metode til kryopræparation af kræftceller og planktonmikroorganismer for HERFD-XAS-speciering af Se8 og Fe9 ved kryogen temperatur.
God praksis for prøveforberedelse og miljø under state-of-the-art XAS-spektroskopimålinger kræver 1) en opsætning; 2) en analyseprocedure, der begrænser virkningerne af strålingsskader så meget som muligt og 3) en prøve (eller model sammensat reference) så homogen som muligt med hensyn til røntgenfotonernes strålestørrelse. Det første element tages i betragtning ved at udføre erhvervelsen ved en lav temperatur ved anvendelse af en flydende heliumkryostat. Det andet punkt behandles ved at udføre hver erhvervelse på et nyt område af prøven ved at flytte det i forhold til strålen. Endelig, i betragtning af den tredje betingelse, konditioneres prøver (pellets) og referencer (pulvere) i pressede bulkpellets for at begrænse porøsiteter og inhomogeniteter så meget som muligt og for at undgå ruhed med hensyn til strålestørrelsen på den røntgenpronderede prøveoverflade. Vi forklarer, hvordan protokollen behandler alle disse punkter.
Vi brugte human prostatacellelinje PC-3 (højt metastatisk potentiale) og ovariecellelinje OVCAR-3 (som tegner sig for op til 70% af alle tilfælde af kræft i æggestokkene) til at undersøge de antiproliferative egenskaber over for kræftceller i selennanopartikler (Se-NP’er) og Phaeodactylum tricornutum diatom som en modelart til at undersøge jernbinding i fytoplankton.
Denne protokol blev brugt til at studere den kemiske form af selen og jern i biologiske prøver ved røntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserer på kryo-forberedelse og opbevaring af biologiske prøver og referenceforbindelser samt på HERFD-XAS-målingerne.
Cryo-forberedelse og opbevaring
Kryopræparatet af de biologiske prøvepiller i bulk gør det muligt at bevare den kemiske integritet af de arter, der er til stede i prøverne. Dette er afgørende, fordi der er obser…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for økonomiske bidrag til beamline-udviklingen fra CEMHTI (Orleans, Frankrig, ANR-13-BS08-0012-01) og Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrig, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-projektet støttes finansielt af det franske “grand emprunt” EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet og INSU CNRS-instituttet. Vi er taknemmelige for alle bidragene under forsøgene, især alle de personer, der arbejder med BM30B og BM16. Forfatterne anerkender den europæiske synkrotronstrålingsfacilitet til levering af synkrotronstrålingsstråletid. Vi anerkender også PHYTOMET ANR-projektet for finansiel støtte (ANR-16-CE01-0008) og SEDMAC-projektet for finansiel støtte (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
Cell scraper | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
Optical microscope | |||
PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
T-75 flasks | |||
Tissue culture hood | |||
Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
Water bath 37°C |