Biologiske prøver Forberedelse til speciering ved kryogen temperatur ved hjælp af røntgenabsorptionsspektroskopi med høj opløsning

Summary

Denne protokol præsenterer en detaljeret procedure til fremstilling af biologiske kryoprøveudler til synkrotronbaserede røntgenabsorptionsspektroskopieksperimenter. Vi beskriver alle de trin, der kræves for at optimere prøveforberedelse og kryopræservering med eksempler på protokollen med kræft- og fytoplanktonceller. Denne metode tilvejebringer en universel standard for prøve kryo-forberedelse.

Abstract

Undersøgelsen af elementer med røntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) er af særlig interesse, når man studerer metallernes rolle i biologiske systemer. Prøveforberedelse er en vigtig og ofte kompleks procedure, især for biologiske prøver. Selvom røntgenspecieringsteknikker er meget udbredt, er der endnu ikke udbredt nogen detaljeret protokol for brugere af teknikken. Endvidere er kemisk tilstandsmodifikation bekymrende, og kryobaserede teknikker anbefales til at analysere de biologiske prøver i deres næsten indfødte hydrerede tilstand for at give den maksimale bevarelse af cellernes eller vævets kemiske integritet. Her foreslår vi en cellulær forberedelsesprotokol baseret på kryo-konserverede prøver. Det er påvist i en højenergiopløsning fluorescens detekteret røntgenabsorptionsspektroskopi undersøgelse af selen i kræftceller og en undersøgelse af jern i fytoplankton. Denne protokol kan bruges sammen med andre biologiske prøver og andre røntgenteknikker, der kan blive beskadiget af bestråling.

Introduction

Undersøgelsen af de cellulære biotransformationer af essentielle eller toksiske elementer kræver specieringsteknikker med høj følsomhed og bør minimere prøveforberedelsestrin, der ofte er tilbøjelige til modifikation af kemiske arter.

Fysiologiske elementer som selen og jern er kendt for at være særligt vanskelige at specificere på grund af deres komplekse kemi, forskellige stabiliteter af selen- eller jernarterne og deres lave koncentration i ppm (mg / kg) eller endda sub-ppm-området. Således kan undersøgelsen af specieringen af disse elementer af XAS være ekstremt udfordrende. Synkrotron XAS og især fluorescens med høj energiopløsning detekteret XAS (HERFD-XAS), som tillader et meget lavt signal-til-baggrund-forhold¹, er tilgængelige ved synkrotronkilder for at specificere stærkt fortyndede elementer i komplekse biologiske matricer ^2,3. Konventionelle fluorescens-XAS-målinger kan udføres ved hjælp af en energiopløst solid state-detektor (SSD) med en energibåndbredde ~ 150-250 eV på CRG-FAME-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴, mens HERFD-XAS-målinger har brug for et krystalanalysatorspektrometer (CAS) med en energibåndbredde ~ 1-3 eV på CRG-FAME-UHD-strålelinjen ved ESRF² . Fluorescensfotoner diskrimineres med hensyn til deres energi med henholdsvis elektroniske eller optiske processer.

Prøve-kryo-præparatet er afgørende for at bevare strukturer og opretholde sammensætningsmæssig kemisk integritet, hvilket muliggør analyse tæt på den biologiske oprindelige tilstand⁵. Desuden tillader analyser udført ved kryogene temperaturer så lave som 10 K ved hjælp af flydende heliumkrogen køling (LN₂), strålingsskader at bremse og bevare elementær speciering for XAS. Selvom nogle anmeldelser af XAS-teknikker anvendt på biologiske prøver rapporterer nødvendigheden af at forberede og analysere prøver under kryogene forhold (f.eks. Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), beskriver ingen af dem klart den relaterede detaljerede protokol. I denne publikation beskrives en metode til kryopræparation af kræftceller og planktonmikroorganismer for HERFD-XAS-speciering af Se⁸ og Fe⁹ ved kryogen temperatur.

God praksis for prøveforberedelse og miljø under state-of-the-art XAS-spektroskopimålinger kræver 1) en opsætning; 2) en analyseprocedure, der begrænser virkningerne af strålingsskader så meget som muligt og 3) en prøve (eller model sammensat reference) så homogen som muligt med hensyn til røntgenfotonernes strålestørrelse. Det første element tages i betragtning ved at udføre erhvervelsen ved en lav temperatur ved anvendelse af en flydende heliumkryostat. Det andet punkt behandles ved at udføre hver erhvervelse på et nyt område af prøven ved at flytte det i forhold til strålen. Endelig, i betragtning af den tredje betingelse, konditioneres prøver (pellets) og referencer (pulvere) i pressede bulkpellets for at begrænse porøsiteter og inhomogeniteter så meget som muligt og for at undgå ruhed med hensyn til strålestørrelsen på den røntgenpronderede prøveoverflade. Vi forklarer, hvordan protokollen behandler alle disse punkter.

Vi brugte human prostatacellelinje PC-3 (højt metastatisk potentiale) og ovariecellelinje OVCAR-3 (som tegner sig for op til 70% af alle tilfælde af kræft i æggestokkene) til at undersøge de antiproliferative egenskaber over for kræftceller i selennanopartikler (Se-NP’er) og Phaeodactylum tricornutum diatom som en modelart til at undersøge jernbinding i fytoplankton.

Protocol

1. Fremstilling af humane PC-3 og OVCAR-3 kræftcellepiller til selenspeciering BEMÆRK: Følgende protokol er tilpasset fra Weekley et al.10. Alle trin skal udføres under en cellekulturhætte under biosikkerhedsniveau 2-betingelser og -begrænsninger ved hjælp af aseptiske teknikker. Tæl cellerne ved hjælp af et Malassez-celletællingskammer. Frø 150.000-200.000 celler pr. kolbe til PC-3-cellelinjen og 300.000 celler til OVCAR-3-cellelinjen. Fr…

Representative Results

Hovedformålene med disse præparater var at undersøge interaktionen mellem selennanopartikler (Se-NP’er) og kræftceller og jernbinding og sekvestrering i fytoplankton. HERFD-XANES-spektre af selen i indledende tilstand (BSA Se-NPs) og i celler inkuberet i næringsmedium (BSA Se-NPs efter 24 timers inkubation) er vist i figur 10. Resultaterne viste, at selen i de indledende Se-NP’er var til stede som både Se(0) og selenitlignende former, mens selen i…

Discussion

Denne protokol blev brugt til at studere den kemiske form af selen og jern i biologiske prøver ved røntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserer på kryo-forberedelse og opbevaring af biologiske prøver og referenceforbindelser samt på HERFD-XAS-målingerne.

Cryo-forberedelse og opbevaring
Kryopræparatet af de biologiske prøvepiller i bulk gør det muligt at bevare den kemiske integritet af de arter, der er til stede i prøverne. Dette er afgørende, fordi der er obser…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C