Biologische monsters voorbereiding voor soortvorming bij cryogene temperatuur met behulp van hoge-resolutie röntgenabsorptiespectroscopie

Summary

Dit protocol presenteert een gedetailleerde procedure om biologische cryosamples voor synchrotron-gebaseerde röntgenabsorptiespectroscopie-experimenten voor te bereiden. We beschrijven alle stappen die nodig zijn om de monstervoorbereiding en cryopreservatie te optimaliseren met voorbeelden van het protocol met kanker- en fytoplanktoncellen. Deze methode biedt een universele standaard voor cryo-voorbereiding van monsters.

Abstract

De studie van elementen met röntgenabsorptiespectroscopie (XAS) is van bijzonder belang bij het bestuderen van de rol van metalen in biologische systemen. Monstervoorbereiding is een belangrijke en vaak complexe procedure, met name voor biologische monsters. Hoewel röntgenspeciatietechnieken veel worden gebruikt, is er nog geen gedetailleerd protocol verspreid voor gebruikers van de techniek. Verder is chemische toestandsmodificatie van belang en worden cryo-gebaseerde technieken aanbevolen om de biologische monsters in hun bijna-inheemse gehydrateerde toestand te analyseren om het maximale behoud van de chemische integriteit van de cellen of weefsels te bieden. Hier stellen we een cellulair voorbereidingsprotocol voor op basis van cryo-geconserveerde monsters. Het wordt aangetoond in een hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerdE röntgenabsorptie spectroscopie studie van selenium in kankercellen en een studie van ijzer in fytoplankton. Dit protocol kan worden gebruikt met andere biologische monsters en andere röntgentechnieken die door bestraling kunnen worden beschadigd.

Introduction

De studie van de cellulaire biotransformaties van essentiële of toxische elementen vereist soortvormingstechnieken met een hoge gevoeligheid en moet monstervoorbereidingsstappen minimaliseren die vaak vatbaar zijn voor modificatie van chemische soorten.

Fysiologische elementen zoals selenium en ijzer staan erom bekend bijzonder moeilijk te specificeren zijn vanwege hun complexe chemie, verschillende stabiliteiten van de selenium- of ijzersoorten en hun lage concentratie in het ppm (mg / kg) of zelfs sub-ppm-bereik. De studie van de soortvorming van deze elementen door XAS kan dus uiterst uitdagend zijn. Synchrotron XAS en met name hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerde XAS (HERFD-XAS), die een zeer lage signaal-tot-achtergrondverhouding¹ mogelijk maakt, zijn beschikbaar bij synchrotronbronnen om sterk verdunde elementen in complexe biologische matrices te speciëren ^2,3. Conventionele fluorescentie-XAS-metingen kunnen worden uitgevoerd met behulp van een energy resolved solid state detector (SSD) met een energiebandbreedte ~ 150-250 eV, op de CRG-FAME-bundellijn bij de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴, terwijl HERFD-XAS-metingen een kristalanalysatorspectrometer (CAS) nodig hebben, met een energiebandbreedte ~ 1-3 eV, op de CRG-FAME-UHD-bundellijn op de ESRF² . Fluorescentiefotonen worden gediscrimineerd met betrekking tot hun energie met respectievelijk elektronische of optische processen.

De cryopreparaat van het monster is essentieel om structuren te behouden en de chemische integriteit van de samenstelling te behouden, waardoor analyse dicht bij de biologische inheemse toestand^{5 mogelijk} is. Bovendien zorgen analyses uitgevoerd bij cryogene temperaturen zo laag als 10 K met behulp van vloeibare helium cryogene koeling (LN₂), ervoor dat stralingsschade vertraagt en elementaire speciatie voor XAS behoudt. Hoewel sommige beoordelingen van XAS-technieken toegepast op biologische monsters de noodzaak melden om monsters in cryogene omstandigheden voor te bereiden en te analyseren (bijv. Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), beschrijft geen van hen duidelijk het gerelateerde gedetailleerde protocol. In deze publicatie wordt een methode beschreven voor cryo-voorbereiding van kankercellen en planktonmicro-organismen voor HERFD-XAS-speciatie van Se⁸ en Fe⁹ bij cryogene temperatuur.

Goede praktijken voor monstervoorbereiding en omgeving tijdens state-of-the-art XAS-spectroscopiemetingen vereisen 1) een opstelling; 2) een analyseprocedure die de effecten van stralingsschade zoveel mogelijk beperkt; en 3) een monster (of model samengestelde referentie) dat zo homogeen mogelijk is ten opzichte van de bundelgrootte van röntgenfotonen. Het eerste item wordt in aanmerking genomen door de acquisitie bij een lage temperatuur uit te voeren, met behulp van een vloeibare helium cryostaat. Het tweede item wordt behandeld door elke acquisitie uit te voeren op een vers deel van het monster door het ten opzichte van de balk te verplaatsen. Ten slotte worden, rekening houdend met de derde voorwaarde, monsters (pellets) en referenties (poeders) geconditioneerd in geperste bulkpellets om porositeiten en inhomogeniteiten zoveel mogelijk te beperken en ruwheid te voorkomen met betrekking tot de bundelgrootte op het oppervlak van het röntgensonde monster. We leggen uit hoe het protocol met al deze punten omgaat.

We gebruikten menselijke prostaatcellijn PC-3 (hoog gemetastaseerd potentieel) en ovariumcellijn OVCAR-3 (die goed is voor maximaal 70% van alle gevallen van eierstokkanker) om de antiproliferatieve eigenschappen ten opzichte van kankercellen van selenium nanodeeltjes (Se-NP’s) en Phaeodactylum tricornutum diatomeeën te onderzoeken als een modelsoort om ijzervastlegging in fytoplankton te onderzoeken.

Protocol

1. Bereiding van de menselijke PC-3 en OVCAR-3 kankercelkorrels voor seleniumspeciatie OPMERKING: Het volgende protocol is aangepast van Weekley et al.10. Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een celkweekkap onder bioveiligheidsniveau 2-omstandigheden en -beperkingen, met behulp van aseptische technieken. Tel de cellen met behulp van een Malassez-celtelkamer. Zaad 150.000-200.000 cellen per kolf voor de PC-3 cellijn en 300.000 cellen voor de OVCAR-3 cel…

Representative Results

De belangrijkste doelen van deze preparaten waren het onderzoeken van de interactie tussen selenium nanodeeltjes (Se-NP’s) en kankercellen, en ijzerbinding en sekwestratie in fytoplankton. HERFD-XANES spectra van het selenium in de begintoestand (BSA Se-NP’s) en in cellen geïncubeerd in voedingsmedium (BSA Se-NP’s na 24 uur incubatie) zijn weergegeven in figuur 10. De resultaten toonden aan dat selenium in de initiële Se-NP’s aanwezig was als zowel Se(0)</s…

Discussion

Dit protocol werd gebruikt om de chemische vorm van selenium en ijzer in biologische monsters te bestuderen door middel van röntgenabsorptiespectroscopie. Het richt zich op de cryo-voorbereiding en opslag van biologische monsters en referentieverbindingen, evenals op de HERFD-XAS-metingen.

Cryo-voorbereiding en opslag
De cryo-voorbereiding van de bulk biologische monsterkorrels maakt het mogelijk om de chemische integriteit van de in de monsters aanwezige soorten te behoud…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C