जैविक नमूने उच्च संकल्प एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर क्रायोजेनिक तापमान पर प्रजातियों के लिए तैयारी
Summary
यह प्रोटोकॉल सिंक्रोट्रॉन-आधारित एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए जैविक क्रायोसम्पल तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। हम कैंसर और फाइटोप्लांकटन कोशिकाओं के साथ प्रोटोकॉल के उदाहरणों के साथ नमूना तैयारी और क्रायोप्रिजर्वेशन को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक सभी चरणों का वर्णन करते हैं। यह विधि नमूना क्रायो-तैयारी का एक सार्वभौमिक मानक प्रदान करती है।
Abstract
एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (एक्सएएस) वाले तत्वों का अध्ययन जैविक प्रणालियों में धातुओं की भूमिका का अध्ययन करते समय विशेष रुचि का है। नमूना तैयारी एक महत्वपूर्ण और अक्सर जटिल प्रक्रिया है, विशेष रूप से जैविक नमूनों के लिए। यद्यपि एक्स-रे विलक्षणता तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, लेकिन तकनीक के उपयोगकर्ताओं के लिए अभी तक कोई विस्तृत प्रोटोकॉल प्रसारित नहीं किया गया है। इसके अलावा, रासायनिक राज्य संशोधन चिंता का विषय है, और क्रायो-आधारित तकनीकों को कोशिकाओं या ऊतकों की रासायनिक अखंडता का अधिकतम संरक्षण प्रदान करने के लिए उनके निकट-देशी हाइड्रेटेड राज्य में जैविक नमूनों का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है। यहां, हम क्रायो-संरक्षित नमूनों के आधार पर एक सेलुलर तैयारी प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। यह एक उच्च ऊर्जा संकल्प प्रतिदीप्ति कैंसर कोशिकाओं में सेलेनियम के एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन और फाइटोप्लांकटन में लोहे के एक अध्ययन का पता लगाया में प्रदर्शित किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य जैविक नमूनों और अन्य एक्स-रे तकनीकों के साथ किया जा सकता है जिन्हें विकिरण द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है।
Introduction
आवश्यक या विषाक्त तत्वों के सेलुलर बायोट्रांसफॉर्मेशन के अध्ययन के लिए उच्च संवेदनशीलता के साथ विलक्षणता तकनीकों की आवश्यकता होती है और नमूना तैयारी के चरणों को कम करना चाहिए जो अक्सर रासायनिक प्रजातियों के संशोधन के लिए प्रवण होते हैं।
सेलेनियम और लोहे जैसे शारीरिक तत्वों को उनके जटिल रसायन विज्ञान, सेलेनियम या लोहे की प्रजातियों की विभिन्न स्थिरताओं, और पीपीएम (मिलीग्राम / किग्रा) या यहां तक कि उप-पीपीएम रेंज में उनकी कम एकाग्रता के कारण विशेष रूप से निर्दिष्ट करना मुश्किल माना जाता है। इस प्रकार, एक्सएएस द्वारा इन तत्वों की प्रजाति का अध्ययन बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है। सिंक्रोट्रॉन एक्सएएस और विशेष रूप से उच्च ऊर्जा रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति का पता लगाया एक्सएएस (एचईआरएफडी-एक्सएएस), जो बहुत कम सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात1 की अनुमति देता है, सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर जटिल जैविक आव्यूहों 2,3 में अत्यधिक पतला तत्वों को निर्दिष्ट करने के लिए उपलब्ध हैं। पारंपरिक प्रतिदीप्ति-XAS माप एक ऊर्जा बैंडविड्थ ~ 150-250 eV के साथ एक ऊर्जा हल ठोस राज्य डिटेक्टर (SSD) का उपयोग करके किया जा सकता है, CRG-FAME बीमलाइन पर यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF)4 पर, जबकि HERFD-XAS माप एक क्रिस्टल विश्लेषक स्पेक्ट्रोमीटर (CAS) की आवश्यकता होती है, एक ऊर्जा बैंडविड्थ ~ 1-3 eV के साथ, CRG-FAME-UHD बीमलाइन पर ESRF2 पर CRG-FAME-UHD बीमलाइन पर . प्रतिदीप्ति फोटॉनों को क्रमशः इलेक्ट्रॉनिक या ऑप्टिकल प्रक्रियाओं के साथ उनकी ऊर्जा के संबंध में भेदभाव किया जाता है।
नमूना क्रायो-तैयारी संरचनाओं को संरक्षित करने और रचनात्मक रासायनिक अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, इस प्रकार जैविक मूल राज्य 5 के करीब विश्लेषण की अनुमति देताहै। इसके अलावा, तरल हीलियम क्रायोजेनिक कूलिंग (एलएन 2) का उपयोग करके 10 K के रूप में कम क्रायोजेनिक तापमान पर किए गए विश्लेषण, विकिरण क्षति को धीमा करने और एक्सएएस के लिए मौलिक प्रजातियों को संरक्षित करने की अनुमति देते हैं। यद्यपि जैविक नमूनों पर लागू एक्सएएस तकनीकों पर कुछ समीक्षाएं क्रायोजेनिक स्थितियों में नमूनों को तैयार करने और उनका विश्लेषण करने की आवश्यकता की रिपोर्ट करती हैं (उदाहरण के लिए, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), उनमें से कोई भी स्पष्ट रूप से संबंधित विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन नहीं करता है। इस प्रकाशन में, कैंसर कोशिकाओं और प्लवक सूक्ष्मजीवों की क्रायो-तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन क्रायोजेनिक तापमान पर Se8 और Fe9 के HERFD-XAS प्रजाति के लिए किया गया है।
अत्याधुनिक एक्सएएस स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के दौरान नमूना तैयारी और पर्यावरण के लिए अच्छा अभ्यास 1) एक सेटअप की आवश्यकता होती है; 2) एक विश्लेषण प्रक्रिया जो विकिरण क्षति के प्रभावों को यथासंभव सीमित करती है; और 3) एक्स-रे फोटॉन बीम आकार के संबंध में जितना संभव हो उतना सजातीय एक नमूना (या मॉडल यौगिक संदर्भ)। पहले आइटम को कम तापमान पर अधिग्रहण करके, एक तरल हीलियम क्रायोस्टेट का उपयोग करके ध्यान में रखा जाता है। दूसरे आइटम को बीम के संबंध में इसे स्थानांतरित करके नमूने के एक नए क्षेत्र पर प्रत्येक अधिग्रहण का प्रदर्शन करके निपटाया जाता है। अंत में, तीसरी स्थिति को ध्यान में रखते हुए, नमूनों (छर्रों) और संदर्भों (पाउडर) को दबाए गए थोक छर्रों में वातानुकूलित किया जाता है ताकि जितना संभव हो सके पोरोसिटिज़ और असमरूपताओं को सीमित किया जा सके, और एक्स-रे जांच किए गए नमूना सतह पर बीम आकार के संबंध में खुरदरापन से बचने के लिए। हम बताते हैं कि प्रोटोकॉल इन सभी बिंदुओं से कैसे निपटता है।
हमने मानव प्रोस्टेट सेल लाइन पीसी -3 (उच्च मेटास्टैटिक क्षमता) और डिम्बग्रंथि सेल लाइन ओवीसीएआर -3 (जो सभी डिम्बग्रंथि के कैंसर के मामलों के 70% तक के लिए खाता है) का उपयोग किया, ताकि सेलेनियम नैनोकणों (से-एनपी) की कैंसर कोशिकाओं के प्रति एंटीप्रोलिफेरेटिव गुणों की जांच की जा सके, और फाइटोप्लांकटन में लोहे के सीक्वेंसिंग की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रजाति के रूप में फेओडैक्टिलम ट्राइकोर्नटम डायटम।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक्स-रे अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जैविक नमूनों में सेलेनियम और लोहे के रासायनिक रूप का अध्ययन करने के लिए किया गया था। यह क्रायो-तैयारी और जैविक नमूनों और संदर्भ यौगिकों क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम CEMHTI (ऑरलियन्स, फ्रांस, ANR-13-BS08-0012-01) और Labex OSUG@2020 (Grenoble, फ्रांस, ANR-10-LABX-0056) द्वारा बीमलाइन विकास में वित्तीय योगदान के लिए आभारी हैं। फेम-यूएचडी परियोजना वित्तीय रूप से फ्रांसीसी “ग्रैंड एम्प्रंट” EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG कंसोर्टियम और INSU CNRS संस्थान द्वारा समर्थित है। हम प्रयोगों के दौरान सभी योगदानों के आभारी हैं, विशेष रूप से BM30B और BM16 पर काम करने वाले सभी व्यक्तियों के लिए। लेखकसिंक्रोट्रॉन विकिरण बीमटाइम के प्रावधान के लिए यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा को स्वीकार करते हैं। हम वित्तीय सहायता (ANR-16-CE01-0008) और वित्तीय सहायता के लिए SEDMAC परियोजना (INCA-Plan Cancer-ASC16019CS) के लिए PHYTOMET ANR परियोजना को भी स्वीकार करते हैं।
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
Referências
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