Подготовка биологических образцов к видообразованию при криогенной температуре с использованием рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения

Summary

Этот протокол представляет собой подробную процедуру подготовки биологических криосамплей для экспериментов с рентгеновской абсорбционной спектроскопией на основе синхротронов. Мы описываем все шаги, необходимые для оптимизации пробоподготовки и криоконсервации, с примерами протокола с раковыми и фитопланктонными клетками. Этот метод обеспечивает универсальный стандарт криоподготовки образцов.

Abstract

Изучение элементов с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии (ХАС) представляет особый интерес при изучении роли металлов в биологических системах. Пробоподготовка является ключевой и часто сложной процедурой, особенно для биологических образцов. Хотя методы рентгеновского видообразования широко используются, подробный протокол еще не был распространен среди пользователей этого метода. Кроме того, модификация химического состояния вызывает беспокойство, и криотехнологии рекомендуются для анализа биологических образцов в их почти нативном гидратированном состоянии, чтобы обеспечить максимальное сохранение химической целостности клеток или тканей. Здесь мы предлагаем протокол клеточной подготовки, основанный на крио-сохраненных образцах. Это проявляется в флуоресцентном рентгеновском спектроскопическом исследовании селена в раковых клетках с высоким разрешением флуоресценции и исследовании железа в фитопланктоне. Этот протокол может быть использован с другими биологическими образцами и другими рентгеновскими методами, которые могут быть повреждены облучением.

Introduction

Изучение клеточных биотрансформаций эссенциальных или токсичных элементов требует методов видообразования с высокой чувствительностью и должно свести к минимуму этапы подготовки образцов, которые часто склонны к модификации химических веществ.

Физиологические элементы, такие как селен и железо, как известно, особенно трудно видообразование из-за их сложного химического состава, различных стабильностей видов селена или железа и их низкой концентрации в диапазоне ppm (мг / кг) или даже ниже ppm. Таким образом, изучение видообразования этих элементов С помощью XAS может быть чрезвычайно сложным. Синхротронный XAS и особенно флуоресцентный XAS с высоким энергетическим разрешением (HERFD-XAS), который допускает очень низкое отношение сигнал/фон¹, доступны на синхротронных источниках для видообразования сильно разбавленных элементов в сложных биологических матрицах ^2,3. Обычные измерения флуоресценции-XAS могут быть выполнены с использованием твердотельного детектора с энергетическим разрешением (SSD) с полосой пропускания энергии ~ 150-250 эВ, на лучевой линии CRG-FAME в Европейской установке синхротронного излучения (ESRF)⁴, в то время как для измерений HERFD-XAS требуется спектрометр кристаллического анализатора (CAS) с полосой пропускания энергии ~ 1-3 эВ, на лучевой линии CRG-FAME-UHD на ESRF² . Флуоресцентные фотоны различаются по отношению к их энергии с помощью электронных или оптических процессов соответственно.

Криоподготовка образца необходима для сохранения структур и поддержания композиционной химической целостности, что позволяет проводить анализ вблизи биологического нативного состояния⁵. Кроме того, анализы, выполняемые при криогенных температурах до 10 К с использованием криогенного охлаждения жидкого гелия (LN₂), позволяют радиационному повреждению замедлить и сохранить элементарное видообразование для XAS. Хотя в некоторых обзорах методов XAS, применяемых к биологическим образцам, сообщается о необходимости подготовки и анализа образцов в криогенных условиях (например, Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), ни один из них четко не описывает соответствующий подробный протокол. В данной публикации описан способ криопрепарации раковых клеток и планктонных микроорганизмов для HERFD-XAS видообразования Se⁸ и Fe⁹ при криогенной температуре.

Надлежащая практика подготовки образцов и окружающей среды во время современных измерений XAS-спектроскопии требует 1) настройки; 2) процедура анализа, максимально ограничивающая последствия радиационного повреждения; и 3) образец (или эталонное соединение модели) как можно более однородный по отношению к размеру пучка рентгеновских фотонов. Первый пункт учитывается при выполнении сбора при низкой температуре, с использованием жидкого криостата гелия. Второй пункт решается путем выполнения каждого захвата на свежем участке образца путем перемещения его относительно луча. Наконец, учитывая третье условие, образцы (гранулы) и референции (порошки) кондиционируются в прессованных объемных гранулах, чтобы максимально ограничить пористость и неоднородность и избежать шероховатости по отношению к размеру пучка на поверхности исследуемого рентгеновского образца. Мы объясняем, как протокол решает все эти вопросы.

Мы использовали клеточную линию предстательной железы человека PC-3 (высокий метастатический потенциал) и клеточную линию яичников OVCAR-3 (на которую приходится до 70% всех случаев рака яичников) для исследования антипролиферативных свойств по отношению к раковым клеткам наночастиц селена (Se-NPs) и Phaeodactylum tricornutum diatom в качестве модельного вида для исследования секвестрации железа в фитопланктоне.

Protocol

1. Подготовка гранул раковых клеток PC-3 и OVCAR-3 человека к видообразованию селена ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол адаптирован из Weekley et al.10. Все этапы должны проводиться под колпаком клеточной культуры в условиях и ограничениях уровня биобезопасности 2, с использ?…

Representative Results

Основными целями этих препаратов были исследование взаимодействия между наночастицами селена (Se-NPs) и раковыми клетками, а также связывания и связывания железа в фитопланктоне. Спектры HERFD-XANES селена в исходном состоянии (BSA Se-NPs) и в клетках, инкубированных в питательной с?…

Discussion

Этот протокол использовался для изучения химической формы селена и железа в биологических образцах с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии. Основное внимание уделяется криоподготовке и хранению биологических образцов и эталонных соединений, а также измерениям HERFD-XAS.

<…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C