Yüksek Çözünürlüklü X-Işını Absorpsiyon Spektroskopisi Kullanılarak Kriyojenik Sıcaklıkta Türleşme için Biyolojik Numunelerin Hazırlanması

Summary

Bu protokol, senkrotron tabanlı X-ışını absorpsiyon spektroskopisi deneyleri için biyolojik kriyoörnekler hazırlamak için ayrıntılı bir prosedür sunar. Numune hazırlama ve kriyoprezervasyonu optimize etmek için gereken tüm adımları, kanser ve fitoplankton hücreleri ile protokol örnekleri ile açıklıyoruz. Bu yöntem, evrensel bir numune kriyo-hazırlama standardı sağlar.

Abstract

X-ışını absorpsiyon spektroskopisi (XAS) ile elementlerin incelenmesi, metallerin biyolojik sistemlerdeki rolünü incelerken özellikle ilgi çekicidir. Numune hazırlama, özellikle biyolojik numuneler için önemli ve genellikle karmaşık bir prosedürdür. X-ışını türleştirme teknikleri yaygın olarak kullanılmasına rağmen, tekniğin kullanıcıları için henüz ayrıntılı bir protokol yayılmamıştır. Ayrıca, kimyasal durum modifikasyonu endişe vericidir ve hücrelerin veya dokuların kimyasal bütünlüğünün maksimum korunmasını sağlamak için biyolojik numuneleri neredeyse doğal hidratlanmış hallerinde analiz etmek için kriyo bazlı teknikler önerilir. Burada, kriyo-korunmuş örneklere dayanan bir hücresel hazırlama protokolü öneriyoruz. Kanser hücrelerinde selenyumun yüksek enerji çözünürlüklü floresan saptanan X-ışını absorpsiyon spektroskopisi çalışmasında ve fitoplanktonda demirin incelenmesinde gösterilmiştir. Bu protokol, diğer biyolojik örnekler ve ışınlama ile zarar görebilecek diğer X-ışını teknikleri ile birlikte kullanılabilir.

Introduction

Esansiyel veya toksik elementlerin hücresel biyotransformasyonlarının incelenmesi, yüksek hassasiyetli türleşme teknikleri gerektirir ve genellikle kimyasal türlerin modifikasyonuna eğilimli numune hazırlama adımlarını en aza indirmelidir.

Selenyum ve demir gibi fizyolojik elementlerin, karmaşık kimyaları, selenyum veya demir türlerinin çeşitli stabiliteleri ve ppm (mg / kg) veya hatta sub-ppm aralığındaki düşük konsantrasyonları nedeniyle türleşmesinin özellikle zor olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, bu elementlerin XAS tarafından türleşmesinin incelenmesi son derece zor olabilir. Senkrotron XAS ve özellikle çok düşük bir sinyal-arka plan oranı^1’e izin veren yüksek enerji çözünürlüklü floresan algılanan XAS (HERFD-XAS), karmaşık biyolojik matrislerde yüksek oranda seyreltilmiş elementleri türleştirmek için senkrotron kaynaklarında mevcuttur ^2,3. Geleneksel floresan-XAS ölçümleri, Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi’ndeki (ESRF)^4’teki CRG-FAME ışın hattında, enerji bant genişliği ~150–250 eV’ye sahip enerji çözümlü bir katı hal dedektörü (SSD) kullanılarak gerçekleştirilebilirken, HERFD-XAS ölçümleri ESRF^2’deki CRG-FAME-UHD ışın hattında ~1–3 eV enerji bant genişliğine sahip bir kristal analizör spektrometresine (CAS) ihtiyaç duyar. . Floresan fotonlar, sırasıyla elektronik veya optik işlemlerle enerjilerine göre ayırt edilir.

Numune kriyo-preparatı, yapıları korumak ve bileşimsel kimyasal bütünlüğü korumak için gereklidir, böylece biyolojik doğal duruma yakın analizlere izin verir⁵. Ayrıca, sıvı helyum kriyojenik soğutma (LN₂) kullanılarak 10 K’ya kadar düşük kriyojenik sıcaklıklarda yapılan analizler, radyasyon hasarının XAS için temel türleşmeyi yavaşlatmasına ve korumasına izin verir. Biyolojik örneklere uygulanan XAS teknikleri üzerine yapılan bazı incelemeler, kriyojenik koşullarda numune hazırlama ve analiz etme gerekliliğini bildirse de (örneğin, Sarret ve ^ark.6, Porcaro ve ^ark.7), hiçbiri ilgili ayrıntılı protokolü açıkça tanımlamamaktadır. Bu yayında, kriyojenik sıcaklıkta Se⁸ ve Fe^9’un HERFD-XAS türleşmesi için kanser hücrelerinin ve plankton mikroorganizmalarının kriyo-hazırlanması için bir yöntem tanımlanmıştır.

Son teknoloji XAS spektroskopisi ölçümleri sırasında numune hazırlama ve çevre için iyi uygulama 1) bir kurulum gerektirir; 2) radyasyon hasarının etkilerini mümkün olduğunca sınırlayan bir analiz prosedürü; ve 3) X-ışını fotonlarının ışın boyutuna göre mümkün olduğunca homojen bir numune (veya model bileşik referansı). İlk madde, bir sıvı helyum kriyostat kullanarak, düşük bir sıcaklıkta elde etme işlemi gerçekleştirilerek dikkate alınır. İkinci madde, numunenin taze bir alanı üzerinde her bir kazanımın, kirişe göre hareket ettirilerek gerçekleştirilmesiyle ele alınır. Son olarak, üçüncü koşul göz önüne alındığında, gözeneklilikleri ve homojensizlikleri mümkün olduğunca sınırlamak ve X-ışını problu numune yüzeyindeki kiriş boyutuna göre pürüzlülüğü önlemek için numuneler (peletler) ve referanslar (tozlar) preslenmiş dökme peletlerde şartlandırılır. Protokolün tüm bu noktalarla nasıl başa çıktığını açıklıyoruz.

İnsan prostat hücre hattı PC-3 (yüksek metastatik potansiyel) ve yumurtalık hücre hattı OVCAR-3’ü (tüm yumurtalık kanseri vakalarının% 70’ini oluşturur) selenyum nanopartiküllerinin (Se-NP’ler) kanser hücrelerine yönelik antiproliferatif özellikleri araştırmak için kullandık ve fitoplanktonda demir tutumunu araştırmak için model bir tür olarak Phaeodactylum tricornutum diatom.

Protocol

1. Selenyum türleşmesi için insan PC-3 ve OVCAR-3 kanser hücresi peletlerinin hazırlanması NOT: Aşağıdaki protokol Weekley et al.10’dan uyarlanmıştır. Tüm adımlar, aseptik teknikler kullanılarak, biyogüvenlik seviye 2 koşulları ve kısıtlamaları altında bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleştirilmelidir. Malassez hücre sayma odasını kullanarak hücreleri sayın. PC-3 hücre hattı için şişe başına 150.000-200.000 h?…

Representative Results

Bu preparatların temel amacı, selenyum nanopartikülleri (Se-NP’ler) ve kanser hücreleri arasındaki etkileşimi ve fitoplanktonlarda demir bağlama ve sekestrasyonunu araştırmaktı. Selenyumun başlangıç halindeki (BSA Se-NP’ler) ve besleyici ortamda inkübe edilen hücrelerdeki (24 saatlik inkübasyondan sonra BSA Se-NP’ler) HERFD-XANES spektrumları Şekil 10’da gösterilmiştir. Sonuçlar, ilk Se-NP’lerdeki selenyumun hem Se (0) hem de selenit benzeri f…

Discussion

Bu protokol, X-ışını absorpsiyon spektroskopisi ile biyolojik örneklerde selenyum ve demirin kimyasal formunu incelemek için kullanılmıştır. Biyolojik numunelerin ve referans bileşiklerin kriyo-hazırlanması ve depolanmasının yanı sıra HERFD-XAS ölçümlerine odaklanmaktadır.

Kriyo-hazırlama ve depolama
Toplu biyolojik numune peletlerinin kriyo-hazırlanması, numunelerde bulunan türlerin kimyasal bütünlüğünün korunmasını sağlar. Bu çok önemli…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C