लाइव सेल में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन को मापने के द्वारा eIF4F विधानसभा की निगरानी
Summary
यहां, हम लाइव कोशिकाओं में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो उपयोगकर्ता को स्क्रीनिंग प्रारूपों में eIF4F जटिल गतिशीलता के दवा प्रेरित क्षोभ का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाएगा।
Abstract
eIF4F परिसर के गठन के लिए संकेत रास्ते है कि अक्सर मनुष्यों में ऑन्कोजेनिक सक्रियण से गुजरना के अभिसरण के लिए महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम नोड दिखाया गया है । eIF4F अनुवाद दीक्षा के एमआरएनए-राइबोसोम भर्ती चरण में शामिल एक कैप-बाध्यकारी परिसर है। कैंसर के कई सेलुलर और पूर्व नैदानिक मॉडल में, eIF4F के विनियमन विशिष्ट mRNA सबसेट है कि कैंसर के प्रसार और अस्तित्व में शामिल है के अनुवाद में वृद्धि की ओर जाता है । eIF4F एक हेट्रो-ट्राइमेरिक कॉम्प्लेक्स है जो कैप-बाइंडिंग सबयूनिट eIF4E, हेलीकेस eIF4A और मचान सबयूनिट eIF4G से बनाया गया है। सक्रिय eIF4F परिसरों की विधानसभा के लिए महत्वपूर्ण eIF4E और eIF4G प्रोटीन के बीच प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत है । इस लेख में, हम eIF4F असेंबली को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो लाइव कोशिकाओं में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन की स्थिति पर नज़र रखता है। eIF4e: 4G सेल आधारित प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख भी eIF4F जटिल अखंडता में दवा प्रेरित परिवर्तन सही और मज़बूती से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है । हम कल्पना करते हैं कि इस विधि को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यौगिकों की गतिविधि को सत्यापित करने या उपन्यास यौगिकों या तौर-तरीकों की आगे की स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है जो eIF4F परिसर के गठन को कुशलतापूर्वक बाधित करते हैं।
Introduction
जीन अभिव्यक्ति का नियंत्रण विकास प्रसार और भेदभाव जैसे सेलुलर कार्यक्रमों के सही निष्पादन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एक नियामक नियंत्रण तंत्र या तो जीन प्रतिलेखन के स्तर पर या एमआरएनए अनुवाद के स्तर पर लगाया जा सकता है। पिछले दशक में, यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि विस्तार और समाप्ति के बाद के चरणों के बजाय दीक्षा प्रक्रिया के मॉड्यूलेशन द्वारा अनुवादात्मक नियंत्रण प्रोटीन के विशिष्ट सबसेट के संश्लेषण को बारीकी से विनियमित कर सकता है जो जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला खेलते हैं।
अस्तित्व में शामिल mRNAs के अनुवाद में वृद्धि, विरोधी ऑटोफैजिक और विरोधी apoptotic प्रतिक्रियाओं कई कैंसर में फंसाया गया है और यह भी कारण या तो गुमराह सक्रियण या अनुवाद दीक्षा कारकों की अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है1।
eIF4F परिसर अनुवाद दीक्षा का एक मास्टर नियामक है। mRNAs के 5 ‘ अंत पर टोपी संरचना बाध्यकारी द्वारा, eIF4F प्रारंभिक mRNA-ribosome भर्ती चला रहा है और बदले में कमजोर अनुवादित यूकेरियोटिक mRNAs2की mRNA अनुवाद दक्षता में वृद्धि । कैंसर से संबंधित mRNAs के eIF4F मध्यस्थता अनुवाद कई कैंसर आरएएस/MAPK या AKT/TOR रास्तों के गुमराह सक्रियण शरण मॉडल के लिए सूचित किया गया है, सुझाव है कि कैंसर की कोशिकाओं eIF4F को अपने स्वयं के समर्थक नियोप्लास्टिक गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए upregulate । eIF4F जटिल गठन को बाधित करके इस फीड-फॉरवर्ड लूप को बाधित करना एक बहुत ही आशाजनक चिकित्सीय रणनीतिहै 3,4.
eIF4F परिसर में (i) eIF4E शामिल हैं, eIF4F की कैप-बाध्यकारी सबयूनिट जो एमआरएनए के 5 यूटीआर में पाए जाने वाले कैप स्ट्रक्चर के साथ इंटरैक्ट करती है, (ii) eIF4A, आरएनए हेलीकेस और (iii) eIF4G, पाड़ प्रोटीन जो eIF4A और eIF4E दोनों के साथ बातचीत करता है और जो अंततः 40S रिबसोमलुनी सबट5की भर्ती करता है। eIF4E के साथ eIF4G एसोसिएशन कार्यात्मक eIF4F परिसरों की असेंबली के लिए दर-सीमित कदम है और यह eIF4E बाध्यकारी प्रोटीन (4EBPs, सदस्यों 1, 2 और 3))6द्वारा नकारात्मक रूप से विनियमित है। एक इंटरफ़ेस के माध्यम से eIF4E के लिए बाध्यकारी eIF4G के साथ प्रतिस्पर्धा करके जिसमें विहित और गैर-विहित eIF4E बाध्यकारी दृश्य7,8,9 (मानव eIF4E पर एए 604-646 फैले क्षेत्र) शामिल हैं, 4EBP सक्रिय रूप से अनुवाद में शामिल eIF4E के पूल को कम करता है और eIF4F जटिल गठन को रोकता है। इन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का इंटरप्ले मुख्य रूप से रैपामाइसिन (mTOR) के स्तनधारी लक्ष्य द्वारा विनियमित किया जाता है- 4EBP के मध्यस्थता फॉस्फोरिलेशन। मिटोजेनिक उत्तेजनाओं पर, mTOR सीधे 4E-BP प्रोटीन परिवार के सदस्यों को फॉस्फोरलेट करता है, जो eIF4E के साथ उनके सहयोग को कम करता है और इस तरह, eIF4E-eIF4G बातचीत को बढ़ावा देने और कार्यात्मक eIF4F परिसरोंके गठन 10।
eIF4F जटिल अखंडता को लक्षित यौगिकों के विकास में महान प्रयास के बावजूद, लाइव कोशिकाओं में eIF4E-eIF4G बातचीत के प्रत्यक्ष व्यवधान को मापने के परख की कमी सेलुलर सक्रिय हिट यौगिकों के लिए खोज सीमित है । हमने eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन के माध्यम से eIF4F अखंडता की स्थिति की वास्तविक समय में निगरानी करने के लिए एक कोएलेंटेरज़ीन एनालॉग (जैसे, नैनोल्यूक-आधारित पूरकता परख) के आधार पर एक लूसिफ़ेरेस परख लागू की है। लूसिफ़ेरेस पूरक प्रोटीन प्रणाली में 18 केडीए प्रोटीन टुकड़ा (SubA) और 11 अमीनो एसिड पेप्टाइड टुकड़ा (SubB) न्यूनतम आत्म-संघ औरस्थिरता 11के लिए अनुकूलित होता है। एक बार मानव पूर्ण लंबाई eIF4E और मानव eiF4G1 (एए 604-646) से eIF4E बातचीत डोमेन के साथ एक संलयन उत्पाद के रूप में व्यक्त किया, दो बातचीत प्रोटीन एक दूसरे के करीब निकटता में SubA और SubB टुकड़ा लाएगा और सक्रिय लूसिफ़ेरेस के गठन के लिए प्रेरित करेगा कि, एक सेल प्रतिमेबल सबस्ट्रेट की उपस्थिति में, अंततः एक उज्ज्वल ल्यूमिन्ससेंट सिग्नल(चित्रा 1)उत्पन्न करेगा। हमने कहीं और eIF4E के निर्माण और सत्यापन की सूचना दी है: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली16।
यहां, हम वर्णन करते हैं कि कैसे eIF4E: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली (अनुरोध पर उपलब्ध) को लाइव कोशिकाओं में 4EBP1-मध्यस्थता eIF4E-eIF4G व्यवधान को सटीक रूप से मापने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हम कई mTOR अवरोधकों के प्रभाव को मापने के द्वारा इसकी उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं जो वर्तमान में संभावित कैंसर चिकित्सीय दवाओं के रूप में नैदानिक परीक्षणों के तहत हैं12। क्योंकि ऑफ-टारगेट प्रभाव अक्सर दवा-विशिष्ट गतिविधि को मुखौटा करते हैं, हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे eIF4E की बहुमुखी प्रतिभा: eIF4G604-646 सिस्टम माप को इन को ध्यान में रखने के लिए सेलुलर व्यवहार्यता के ऑर्थोगोनल मापों के साथ बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में वर्णित विधि लाइव कोशिकाओं में eIF4G-eIF4E इंटरैक्शन के प्रत्यक्ष माप के माध्यम से eIF4F परिसर असेंबली की मात्रात्मक निगरानी करने के लिए एक लूसिफ़ेरेस-आधारित पूरकता परख का उपयोग करती है। हमने eIF4E-eIF4G पूर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को p53lab (BMSI, A * STAR) और जेसीओ वीआईपी ग्रांट (ए * स्टार) से कोर बजट द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
Referências
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