Microwaving e Fluorophore-Tyramide para Imunocoloração Multiplex em Adrenals de camundongos − Usando Anticorpos primários conjugados da mesma espécie hospedeira

Resumo

Vários métodos diferentes foram estabelecidos para a imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira. Aqui, descrevemos o uso de anticorpos mediados por micro-ondas e de fluoroforre-tyramida para bloquear a reatividade cruzada de anticorpos durante a imunocoloração multiplex em seções adrenal de camundongos forjadas fixadas em formalina.

Resumo

A imunocoloração é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas para mostrar o padrão de expressão celular de uma determinada proteína. A imunocoloração multiplex permite rotular usando múltiplos anticorpos primários. Para minimizar a reatividade cruzada de anticorpos, a imunocoloração multiplex usando manchas indiretas requer anticorpos primários não rotulados de diferentes espécies hospedeiras. No entanto, a combinação apropriada de diferentes anticorpos de espécies nem sempre está disponível. Aqui, descrevemos um método de uso de anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira (por exemplo, neste caso, ambos os anticorpos são de coelho) para imunofluorescência multiplex em seções adrenal de camundongos forfinados fixadas (FFPE). Este método utiliza o mesmo procedimento e reagentes utilizados na etapa de recuperação de antígenos para despir a atividade do complexo de anticorpos primários anteriormente manchado. Slides foram manchados com o primeiro anticorpo primário usando um protocolo geral de imunocoloração seguido de um passo de ligação com um anticorpo secundário biotinylado. Em seguida, um método de desenvolvimento de sinal avidin-biotina-peroxidase foi usado com fluorofide-tyramida como substrato. A imunoatividade do primeiro complexo primário de anticorpos foi despojada através da imersão em uma solução de citrato de sódio fervente micro-ondas por 8 min. O deposição fluorofídeo insolúvel permaneceu na amostra, o que permitiu que o slide fosse manchado com outros anticorpos primários. Embora este método elimine a maioria dos sinais positivos falsos, alguns antecedentes da reatividade cruzada de anticorpos podem permanecer. Se as amostras forem enriquecidas com biotina endógena, um anticorpo secundário conjugado por peroxidase pode ser usado para substituir o anticorpo secundário biotinylado para evitar o falso positivo da biotina endógena recuperada.

Introdução

Na imunocoloração multiplex, a coloração direta usando anticorpos primários conjugados pode fornecer resultados informativos. Sem o uso de anticorpos secundários, o método de coloração direta tem baixo risco de falsos sinais de colocalização da reatividade cruzada de anticorpos. No entanto, os repórteres conjugados (fluorofóbico, enzimas) ou biotina no anticorpo primário limitam seu uso futuro. Alternativamente, a imunocoloração indireta geralmente fornece sinais mais fortes usando um anticorpo primário não conjugado com um anticorpo secundário rotulado. Idealmente, anticorpos primários não conjugados usados na imunocoloração multiplex devem vir de diferentes espécies....

Protocolo

1. Colorir com o Primeiro Anticorpo

1. Depilação e rehidratação de ffpe slides com 5 min alocados em cada uma das seguintes etapas: xileno ou reagentes equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x e água destilada 2x.
   NOTA: Os slides devem permanecer úmidos a partir desta etapa de reidratação até a montagem na etapa final.
2. Para recuperação opcional de antígeno, coloque os slides em 275 mL de solução de citrato de sódio fervente (10 mM, pH = 6,0) por 8 min. Para manter a solução fervendo, coloque os slides lisos na parte inferior de uma caixa de ponta de tubulação de 14 x 9,5 x 9 cm³ (W x L x H) com tampa e....

Resultados

Os resultados foram obtidos a partir de amostras tratadas com todas as etapas descritas, incluindo a etapa 1.2 de recuperação de antígenos. Todos os anticorpos secundários usados aqui estavam biotinylated. O fluoroforreio-tyramida foi usado para desenvolver sinais do primeiro e segundo anticorpos primários. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência equipado com um cubo FITC (para fluorescência verde), um cubo TxRED (para Cy3) e um cubo DAPI (para DAPI).

Discussão

A imunocoloração multiplex é útil para examinar a colocalização celular de dois ou mais antígenos. Esta técnica amplamente utilizada dá resultados convincentes de colocalização quando os anticorpos primários são conjugados com diferentes repórteres (coloração direta). No entanto, a coloração direta geralmente fornece sinais mais fracos em comparação com a coloração indireta, que envolve anticorpos secundários conjugados para detectar os anticorpos primários. Na coloração indireta, um resultado de imunocoloração multiplex.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Montagem Antifade	Vector Laboratories	H-1000
Burro biotinilado anti-rato	JacksonImmuno	715-066-151	Diluição 1:500
Burro biotinilado anti-coelho	JacksonImmuno	711-066-152	Diluição 1:500
DAPI	BioLegend	422801	2 μ g/mL em água destilada
Microscópio de fluorescência	ECHO	Revolve 4
Estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano	JacksonImmuno	016-030-084	Diluição 1:1.000
Forno de microondas, 700 W	General Electric	JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2	Santa Cruz	SC-374540	Diluição 1:250
Mouse anti-TH	Santa Cruz	SC-25269	diluição 1:1.000
Soro normal de burro	JacksonImmuno	017-000-121	Soro a 2% em PBST
Rabbit anti-20α HSD	Kerafast	EB4002	1:500 diluição
Coelho anti-3β HSD	TransGenic	KO607	diluição 1:250
Coelho anti-TH	NOVUS	NB300-109	Diluição 1:1.000
Coelho anti-β-catenina	Abcam	ab32572	Diluição 1:500
Estreptavidina Rábano Peroxidase (SA-HRP)	JacksonImmuno	016-303-084	Diluição 1:1.000
TSA Cy3 Tyramide	PerkinElmer	SAT704B001EA	Diluição 1:100
TSA Fluoresceína Tiramida	PerkinElmer	SAT701001EA	diluição 1:100