Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Lindsey  K. Sablatura; Kristin  M. Bircsak; Peter Shepherd; Karla Queiroz; Mary  C. Farach-Carson; Pamela  E. Constantinou; Anthony Saleh; Nora Navone; Daniel A. Harrington

doi:10.3791/60872

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Artigo de método

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

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DOI:

10.3791/60872

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5 de dezembro de 2020

Lindsey K. Sablatura¹ , Kristin M. Bircsak² , Peter Shepherd³ , Karla Queiroz⁴ , Mary C. Farach-Carson¹^,⁵^,⁶ , Pamela E. Constantinou¹^,⁷ , Anthony Saleh² , Nora Navone³ , Daniel A. Harrington¹^,⁵^,⁶

¹Department of BioSciences, Rice University, ²Mimetas US Inc, ³Department of Genitourinary Medical Oncology Research, Division of Cancer Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, ⁴Mimetas B.V., ⁵Department of Bioengineering, Rice University, ⁶Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center, ⁷Sheikh Ahmed Center for Pancreatic Cancer Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Neste artigo

Resumo

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Resumo

Os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), gerados quando ressecados do tecido tumoral do paciente são grafados diretamente em camundongos imunocomprometidos, permanecem biologicamente estáveis, preservando características moleculares, genéticas e histológicas, bem como a heterogeneidade do tumor original. No entanto, usar esses modelos para realizar uma infinidade de experimentos, incluindo a triagem de medicamentos, é proibitivo tanto em termos de custo quanto de tempo. Sistemas de cultura tridimensional (3D) são amplamente vistos como plataformas nas quais as células cancerígenas retêm sua integridade biológica através de interações bioquímicas, morfologia e arquitetura. Nossa equipe tem ampla experiência em cultivo de células PDX in vitro usando matrizes 3D compostas de ácido hialurônico (HA). A fim de separar as células estromais do fibroblasto do camundongo associadas aos PDXs, usamos cultura de rotação, onde células estromais aderem à superfície das placas tratadas pela cultura tecidual enquanto células tumorais PDX dissociadas flutuam e se associam a aglomerados multicelulares. Também flutuando no supernante estão células solteiras, muitas vezes mortas, que representam um desafio na coleta de agrupamentos PDX viáveis para encapsulamento a jusante em hidrogéis para cultura celular 3D. Para separar essas células únicas de aglomerados de células vivas, empregamos centrifugação gradiente de passo de densidade. O protocolo aqui descrito permite o esgotamento de células únicas não viáveis da população saudável de aglomerados celulares que serão usados para mais experimentações in vitro. Em nossos estudos, incorporamos as culturas 3D em placas microfluidas que permitem a perfusão da mídia durante a cultura. Depois de avaliar as culturas resultantes usando um ensaio de viabilidade baseado em imagem fluorescente de células purificadas versus não purificadas, nossos resultados mostram que essa etapa de separação adicional reduziu substancialmente o número de células não viáveis de nossas culturas.

Introdução

Na última década, o campo da pesquisa sobre o câncer demonstrou um entusiasmo renovado pelos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) como uma ferramenta para avaliar a dependência da via celular do câncer e a suscetibilidade de medicamentos¹. Os modelos PDX mais comuns são estabelecidos pela implantação subcutânea ou ortotópica de células tumorais humanas — um fragmento de tumor, um conjunto de células derivadas de tumor dissociados ou uma amostra de células tumorais circulantes isoladas (CTCs) — em um hospedeiro de roedores. Se o tumor "tomar" for bem sucedido, as células de xenoenxerto se proliferarão, vascularizarão e interagirão com o tec....