浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上
Summary
本プロトコルは、患者由来異種移植片(PDX)の拡張in vitro培養を可能にする方法を示す。1つのステップは、非生存可能な単一細胞を簡単に除去することで、3Dヒドロゲルにおける多細胞クラスター培養の全体的な生存率を高めます。二次ステップは、パーフューズされたマイクロ流体プラットフォームにおけるPDX培養のベストプラクティスを示します。
Abstract
切除された患者の腫瘍組織が免疫不全マウスに直接生じたときに生成される患者由来の異種移植片(PDX)は、生物学的に安定なままであり、それによって、分子、遺伝的、および組織学的特徴、ならびに元の腫瘍の不均一性を維持する。しかし、これらのモデルを使用して薬物スクリーニングを含む多数の実験を行うことは、コストと時間の両方の面で非常に高い。3次元(3D)培養システムは、がん細胞が生化学的相互作用、形態、建築を通じて生物学的完全性を保持するプラットフォームとして広く見られている。当社のチームは、ヒアルロン酸(HA)で構成された3Dマトリックスを用いて、インビトロでPDX細胞を培養した豊富な経験を持っています。PDXに関連するマウス線維芽細胞間質細胞を分離するために、我々は回転細胞が組織培養処理プレートの表面に付着し、PDX腫瘍細胞を浮遊させ、多細胞クラスターに自己関連付ける回転培養を使用する。また、上清に浮遊する単一の死細胞は、3D細胞培養のためのヒドロゲルへの下流カプセル化のための実行可能なPDXクラスターを収集する際に課題を提示する。これらの単一細胞を生細胞クラスターから分離するために、我々は密度ステップ勾配遠心分離を採用した。ここで説明するプロトコルは、さらなるインビトロ実験に使用される細胞クラスターの健全な集団からの非生存可能な単一細胞の枯渇を可能にする。我々の研究では、培養中の培地灌流を可能にするマイクロ流体プレートに3D培養を組み込む。精製細胞と非精製細胞の蛍光画像ベースの生存アッセイを用いて得られた培養物を評価した結果、この追加分離ステップが、我々の培養物からの非生存細胞の数を大幅に減少させたことを示した。
Introduction
過去10年間、がん研究の分野は、がん細胞経路の依存性および薬物感受性を評価するためのツールとして、患者由来の異種移植片(PDXs)に対する新たな熱意を示してきた。最も一般的なPDXモデルは、ヒト腫瘍細胞の皮下または異形移植(腫瘍断片、解離された腫瘍由来細胞のクラスター、または単離循環腫瘍細胞(CTC)のサンプル)によってげっ歯類宿主に確立される。腫瘍の「テイク」が成功した場合、異種移植細胞は増殖し、血管化し、そうでなければ宿主組織と相互作用して腫瘍を作り出し、最適なサイズで収穫し、細分化し、他の宿主に再移植することができる。モデルシステムとしてのそれらの多くの利点の中で、PDXsは典型的には、天然腫瘍細胞集団の不均一性のかなりの部分を保持し、ヒト特異的経路および細胞応答の評価を可能にする22、3。3in vivoコンテキストは、血管系および他の隣接する間質との腫瘍相互作用を可能にし、薬物拡散ダイナミクス、酸素張力、および生物学的および機械的に腫瘍の進行に影響を与える細胞外マトリックスの影響などの組織特性を再現する。PDXの否定的な側面は、腫瘍の拡大と最終的には仮説検査の両方に対するげっ歯類宿主への依存である。多くのPDXは、望ましい特性の多くを失うことなく、組織培養ポリスチレンの伝統的な2次元(2D)培養に適応できないため、この比較的制御されたインビトロ法と、生体内PDX使用の費用、施設、および時間要件の大幅な増加の間に研究者のための最小限の中間地点がありました。
我々は、支持的なマトリックス内で3D細胞培養を実施する複数のインビトロモデルを説明し、最近、骨髄由来線維芽細胞44,55と共培養する単独で、また骨髄由来のPDXと共培養して、複数の前立腺癌(PCa)由来PDXのエクスビボ培養を実証する作業を拡大した。ヒアルロン酸(HA)ベースのヒドロゲルマトリックスは、ヒドロゲル深度6を介したイメージングのためのヒドロゲル特性および光学的明瞭性を簡単に制御して、両方の細胞タイプにカスタマイズ可能かつ生物学的に関連するサポートを提供する。
成熟したPDX腫瘍組織は、異種ヒト癌細胞とマウス間質(線維芽細胞、内皮細胞など)の可変混合物を含む。インビトロで腫瘍進行に対する細胞型特異的な寄与を研究するために、腫瘍を解離し、細胞集団を分離し、それらを組織的に組み込んで細胞間コミュニケーションの経路を解剖することが有利である。組織のデジエステート内の混合細胞集団は、特定の培養条件との相性が異なる。例えば、腫瘍関連線維芽細胞の生存率は、インテグリンリガンドで機能する表面付着または3Dマトリックスのいずれかを必要とし、上皮由来PDX細胞は通常これらの要件を有せず、代わりに細胞細胞相互作用を好む。これらの違いは、PDX細胞を汚染するマウス間質細胞からの効果的な分離を達成するために利用することができる。組織デジエステートの回転培養により、細胞細胞の接着が組織培養表面に付着し、細胞-細胞接着は回転培養表面の上に浮遊するPDX細胞を駆動し、上清中に24〜48時間で多細胞クラスターを形成する。これらのクラスターの特定の特性は、PDX(例えば、大きく、タイトで、球状の高いクラスターまたはブドウの束に似たより緩い凝集体)によって異なりますが、通常は生物学的に関連するサイズ(50-250 μm直径)であり、細胞間接触に依存する細胞相互作用を評価するのに十分です。
腫瘍の検索と処理は、機械的/酵素的破壊による短期的な損傷、または選択された培養条件との亜集団の長期的な不適合性のいずれかによる、ある程度の担保細胞死をもたらす。初期のバルク分離としての回転培養の有用性にもかかわらず、死細胞または死死細胞は必然的にPDXクラスターと共に移され、結果として生じる培養に影響を与える可能性がある。これらの死細胞は、クラスターに統合されなかった個々のPDX細胞、選択した培養条件で生き残ることができないマウス間質線維芽細胞、または特に脆弱な内皮細胞である。このような死細胞は、「生存者」からの実験結果に影響を及ぼし、例えば蛍光画像ベースの生存率スクリーニングアッセイを介して定量に実質的に影響を与える可能性がある。この方法から生きたPDX細胞の選択を改善するために、我々は容易にPDX混合物から個々の死滅/死細胞を除去し、主に生きている多細胞クラスターを保持するために密度ステップを有する遠心分離法を適応した。
3D培養における結果として得られるPDX由来クラスターの研究を強化するために、我々はマイクロ流体ベースの灌流培養プラットフォームであるOrganoPlate(図1)を利用し、384マイクロウェルチタープレートベース上で最大96個のパーフュード3D培養を同時培養できる高スループットのオルガン・オン・チップ・プラットフォームである(図1A)77.82レーンマイクロ流体プレートでは、1つの組織チップが2つのマイクロ流体チャネル(図1B、ゲルチャネル:赤、灌流チャネル:青)によって接続され、4つのウェルが連続して広がります。2つのマイクロ流体チャネルは、隣接する隣接チャネルへの1つのチャネルのオーバーフローを防止するフェーズガイドと呼ばれる短いプラスチック製の尾根によって分離され、同時にゲルの内容物と灌流チャネル9との間の膜のない界面を可能にする。マイクロ流体プレートの底部は顕微鏡グレードのガラスで構成されているため、標準的な顕微鏡または自動顕微鏡でプレートの底を通して観察窓で培養を見ることができます。灌流は、マイクロ流体チャネルを介して媒体を駆動するために重力を使用して、貯蔵井戸の間に、プログラム可能なロッカーとマイクロ流体プレートに確立される(図1C)。灌流フロー模倣は、静的培養よりも腫瘍微小環境をより密接に再現し、せん断応力の取り込みとガスおよび栄養素の分布の強化を可能にする。マイクロ流体プレートにおけるパーフューズド癌細胞培養を維持する利点は、同じ細胞の静的3D培養と比較して最適な生存率を示したパーフューズド乳癌培養物として以前に記載されている7。
本報告書は、生きた多細胞PDXクラスターを単離するための適応密度勾配遠心分離法を説明し、透過性マイクロ流体プレート内で3D PDX培養を確立する際にその有用性を示す。PDXの使用を容易にする方法を求めている研究所が増えているため、ここで紹介するプロトコルは即時に役立つと予想しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、高スループットの3D培養システムにおける生き生きとPDX由来腫瘍細胞の処理および培養方法について説明する。このプロトコルはPCa PDX組織を利用するが、他の上皮由来腫瘍にも同様に有効である。腫瘍の特徴は、同じ起源の組織(前立腺、乳房など)内であっても、個々のPDXライン間で変化する。いくつかの PCa PDX ラインは、より繊維性および他の細胞がより細胞性である間から生?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所SBIRフェーズI(HHSN26120700015C)およびP01CACA098912によって支援されました。
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
Referências
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Pesquisa do Câncer. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
