Vi har tidligere valideret en protokol for amplicon-baseret hele genom Usutu virus (USUV) sekventering på en nanopore sekventering platform. Her beskriver vi de anvendte metoder mere detaljeret og bestemmer fejlhastigheden for nanopore R10 flowcellen.
Hele genomsekvensering kan bruges til at karakterisere og spore virusudbrud. Nanopore-baserede hele genom sekvensering protokoller er blevet beskrevet for flere forskellige vira. Disse tilgange anvender en overlappende ampliconbaseret tilgang, som kan bruges til at målrette mod en bestemt virus eller gruppe af genetisk beslægtede vira. Ud over bekræftelse af virustilstedeværelsen kan sekvensering anvendes til genomiske epidemiologiske undersøgelser til at spore virus og optrævle oprindelser, reservoirer og transmissionsmåder. For sådanne applikationer er det afgørende at forstå mulige virkninger af fejlprocenten i forbindelse med den anvendte platform. Rutinemæssig anvendelse i kliniske og folkesundhedsmæssige indstillinger kræver, at dette er dokumenteret med alle vigtige ændringer i protokollen. Tidligere blev en protokol for hele genomet Usutu virus sekventering på nanopore sekventering platform valideret (R9.4 flowcell) ved direkte sammenligning med Illumina sekventering. Her beskriver vi den metode, der bruges til at bestemme den krævede læsedækning, ved hjælp af sammenligningen mellem R10-flowcellen og Illumina-sekvenseringen som et eksempel.
Hurtig udvikling inden for tredje generations sekvensteknologier giver os mulighed for at bevæge os fremad mod tæt på realtidssekvensering under virusudbrud. Denne rettidige tilgængelighed af genetiske oplysninger kan være nyttig til at bestemme oprindelsen og udviklingen af virale patogener. Guld standarder inden for næste generation sekventering dog er stadig den anden generation sequencere. Disse teknikker er afhængige af specifikke og tidskrævende teknikker som klonal forstærkning under en emulsion PCR eller klonal bro forstærkning. Den tredje generation sequencere er billigere, håndholdte og kommer med forenklede bibliotek forberedelse metoder. Især den lille størrelse af sekvensen enhed og den lave købspris gør det til en interessant kandidat til deployerbare, markable sekvensering. Dette kunne for eksempel ses under udbruddet af ebolavirus i Sierra Leone og under de igangværende undersøgelser af udbrud af arbovirus i Brasilien1,2,3. Den rapporterede høje fejlfrekvens4 kan dog begrænse de applikationer, som nanoporesekventering kan anvendes til.
Nanopore sekventering udvikler sig hurtigt. Nye produkter er tilgængelige på markedet på regelmæssig basis. Eksempler herpå er for eksempel de 1D kvadrerede sæt, som gør det muligt at sekventere begge dele af DNA-molekylet, hvilket øger nøjagtigheden af de såkaldte baser5 og udviklingen af R10-flowcellen, som måler ændringen i strøm ved to forskellige forekomster i pore6. Desuden vil forbedrede bio-informatik værktøjer som forbedringer i basecalling forbedre nøjagtigheden af basecalling7. En af de hyppigst anvendte basecallers (f.eks.5 For nylig, producenten også udgivet en ny basecaller kaldet flip-flop, som er implementeret i standard nanopore software8. Tilsammen vil alle disse forbedringer føre til mere præcise sekvenser og vil reducere fejlprocenten for nanopore sequencer.
Usutu virus (USUV) er en myg-bårne arbovirus af familien Flaviviridae og det har en positiv-strandede RNA genom på omkring 11.000 nukleotider. USUV påvirker hovedsageligt store gråugler og solsorte9,10, selv om andre fuglearter også er modtagelige for USUV-infektion11. For nylig, USUV blev også identificeret i gnavere og spidsmus, selv om deres potentielle rolle i overførsel af virus forbliver ukendt12. Hos mennesker er asymptomatiske infektioner blevet beskrevet hos bloddonorerne 13,14,15,16 ,mens usuv-infektioner også er blevet rapporteret at være forbundet med encephalitis eller meningo-encephalitis17,18. I Holland blev USUV først påvist hos vilde fugle i 201610 og hos asymptomatiske bloddonorer i 201814. Siden den første påvisning af USUV, udbrud er blevet rapporteret i de efterfølgende år og overvågning, herunder hele genom sekventering, er i øjeblikket i gang for at overvåge dukke og spredning af en arbovirus i en tidligere naiv befolkning.
Svarende til, hvad der er blevet beskrevet for andre vira, såsom Ebola virus, Zika virus og gul feber virus3,19,,20,vi har udviklet en primer indstillet til sekvens fuld længde USUV21. Denne polymerase kædereaktion (PCR)-baseret tilgang giver mulighed for inddrivelse af fuld længde USUV genomer fra meget vært-forurenet prøvetyper som hjerneprøver i prøver op til en Ct-værdi på omkring 32. Fordelene ved en amplicon-baseret sekventering tilgang er en højere følsomhed i forhold til metagenomic sekventering og en højere specificitet. Begrænsninger ved at bruge en amplicon-baseret tilgang er, at sekvenserne skal være ens for at designe primere montering alle stammer, og at primere er designet på vores nuværende viden om virus mangfoldighed.
I betragtning af den konstante udvikling og forbedringer i tredje generations sekvensering er der behov for regelmæssigt at vurdere sekvenserens fejlprocent. Her beskriver vi en metode til at evaluere nanoporens ydeevne direkte mod Illumina-sekvensering ved hjælp af USUV som eksempel. Denne metode anvendes på sekvenser, der genereres med den nyeste R10-flowcelle, og basecalling udføres med den nyeste version af flip-flop basecaller.
Nanopore sekventering er i konstant udvikling, og derfor er der behov for metoder til at overvåge fejlprocenten. Her beskriver vi en arbejdsgang til overvågning af fejlprocenten for nanopore sequencer. Dette kan være nyttigt efter udgivelsen af en ny flowcelle, eller hvis nye versioner af basecalling frigives. Dette kan dog også være nyttigt for brugere, der vil konfigurere og validere deres egen sekvensprotokol.
Forskellige software- og justeringsværktøjer kan give forskellige resultater33. I dette manuskript tilstræbede vi at bruge frit tilgængelige softwarepakker, der er almindeligt anvendt, og som har klar dokumentation. I nogle tilfælde kan kommercielle værktøjer foretrækkes, som generelt har en mere brugervenlig grænseflade, men som skal betales. I fremtiden kan denne metode anvendes på den samme prøve i tilfælde af store ændringer i sekvens teknologi eller basecalling software indføres Fortrinsvis dette bør ske efter hver opdatering af basecaller eller flowcell, men i betragtning af hastigheden af den aktuelle udvikling dette kan også gøres først efter større opdateringer.
Reduktionen i fejlprocenten i sekvensering giver mulighed for et højere antal prøver, der skal multiplekseres. Derved er nanopore sekventering komme tættere på at erstatte konventionelle real time PCR til diagnostiske analyser, hvilket allerede er tilfældet for influenza virus diagnostik. Desuden øger reduktionen af fejlprocenten anvendeligheden af denne tekniksekvens, f.eks.
Et kritisk skridt i protokollen er, at tætte, pålidelige referencesekvenser skal være tilgængelige. Primerne er baseret på den nuværende viden om virus mangfoldighed og måske skal opdateres en gang imellem. Et andet kritisk punkt, når du opretter en amplicon-baseret sekventering tilgang er afvejning af primer koncentration for at få en jævn balance i amplicon dybde. Dette gør det muligt at multipleksere flere prøver på en sekvenskørsel og resulterer i en betydelig omkostningsreduktion.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde har modtaget støtte fra EU’s forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 under tilskudsaftale nr.
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
dNTPs | Qiagen | 201900 | |
FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
Random Primers | Promega | C1181 | |
RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |