우리는 이전에 나노 기공 시퀀싱 플랫폼에서 앰플리코 기반 전체 게놈 우스투 바이러스 (USUV) 시퀀싱에 대한 프로토콜을 검증했습니다. 여기서, 보다 자세하게 사용되는 방법을 설명하고 나노기공 R10 유량 셀의 오차율을 결정한다.
전체 게놈 시퀀싱은 바이러스 발병을 특성화하고 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 나노기공 계 전체 게놈 시퀀싱 프로토콜은 여러 가지 다른 바이러스에 대해 기재되었다. 이 접근은 유전으로 관련한 바이러스의 특정 바이러스 또는 단을 표적으로 하기 위하여 이용될 수 있는 겹치는 amplicon 기지를 둔 접근을 이용합니다. 바이러스 존재의 확인 이외에, 시퀀싱은 바이러스를 추적하고 기원, 저수지 및 전송 의 모드를 해명하기 위하여 게놈 역학 연구 결과를 위해 이용될 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램의 경우 사용되는 플랫폼과 관련된 오류율의 가능한 영향을 이해하는 것이 중요합니다. 임상 및 공중 보건 설정에서 일상적인 응용 프로그램은 프로토콜의 모든 중요한 변경사항과 함께 문서화해야 합니다. 이전에는 나노기공 시퀀싱 플랫폼에서 전체 게놈 우스투 바이러스 시퀀싱에 대한 프로토콜이 일루미나 시퀀싱과 직접 비교하여 검증되었습니다(R9.4 플로셀). 여기서, 우리는 R10 유동 셀과 일루미나 시퀀싱 사이의 비교를 예로 사용하여 필요한 판독 범위를 결정하는 데 사용되는 방법을 설명한다.
3세대 서열 기술의 빠른 개발을 통해 바이러스 발생 시 실시간 시퀀싱에 가까운 방향으로 나아갈 수 있습니다. 유전 정보의 이 적시 가용성은 바이러스 성 병원체의 기원 그리고 진화를 결정하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나 차세대 염기서열 분석 분야의 금 표준은 여전히 2세대 시퀀서입니다. 이러한 기술은 에멀젼 PCR 또는 클론 브리지 증폭 중에 클론 증폭과 같은 특정하고 시간이 많이 소요되는 기술에 의존합니다. 3 세대 시퀀서는 저렴, 휴대용 및 단순화 된 라이브러리 준비 방법론과 함께 제공됩니다. 특히 시퀀스 장치의 작은 크기와 낮은 구매 가격으로 배포 할 수있는 필드 시퀀싱을위한 흥미로운 후보가됩니다. 이것은 예를 들면 시에라리온에 있는 에볼라 바이러스 발발 도중 및브라질에있는 진행중인 arbovirus 발발 조사 도중 볼 수 있었습니다1,22,3. 그러나 보고된 높은 오류율4는 나노기공 시퀀싱을 사용할 수 있는 응용을 제한할 수 있습니다.
나노기공 시퀀싱은 빠르게 진화하고 있습니다. 신제품은 정기적으로 시장에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어 DNA 분자의 두 가닥의 시퀀싱을 가능하게 하는 1D 제곱 키트가 예를 들어, 기체5라고 불리는 정확도를 높이고, 기공6의2개의 상이한 인스턴스에서 전류의 변화를 측정하는 R10 유량 세포의 개발이 가능하다. 또한 베이스콜 개선과 같은 향상된 생체 정보 도구는베이스콜7의 정확도를 향상시킵니다. 가장 자주 사용되는 베이스콜러 중 하나(예: 알바코어)는 9개월 기간5에서최소 12회 업데이트되었습니다. 최근, 제조 업체는 또한 기본 나노 기공 소프트웨어8에서구현되는 플립 플롭이라는 새로운 basecaller를 발표했다. 함께, 이러한 개선의 모든 보다 정확한 시퀀스로 이어질 것입니다 및 나노 기공 시퀀서의 오류 율을 감소시킬 것이다.
우스투 바이러스(USUV)는 플라비리대 가족의 모기 매개 아르보바이러스이며 약 11,000개의 뉴클레오티드의 양성 가닥 RNA 게놈을 가지고 있다. USUV는 주로 큰 회색 올빼미와 블랙 버드 에 영향을미치는 9,,10,다른 조류 종은 USUV 감염에 취약하지만11. 최근, USUV는 또한 설치류와 슈루에서 확인되었지만 바이러스의 전염에 있는 그들의 잠재적인 역할은 알려지지 않은12남아있다. 인간에서 무증상 감염은 혈액 기증자13,,14,,15,,16에서 기재되었으며 USUV 감염은 뇌염 또는 수막뇌염17,,18과관련이 있는 것으로 보고되었다. 네덜란드에서 USUV는 2016년10마리의 야생 조류에서 처음 발견되었으며, 2018년14년에는무증상 혈액 기증자에서 처음 발견되었습니다. USUV의 초기 검출 이후, 발발은 전체 게놈 순서를 포함하여 후속 년 및 감시 도중 보고되었습니다, 이전에 순진한 인구에 있는 arbovirus의 출현 그리고 퍼짐을 감시하기 위하여 현재 진행되고 있습니다.
에볼라 바이러스, 지카 바이러스 및 황열병 바이러스3,,19,,20과 같은 다른 바이러스에 대해 설명된 것과 유사하게, 우리는 전체 길이 USUV21을서열로 설정하는 프라이머 세트를 개발했다. 이 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기지를 둔 접근은 약 32의 Ct 값까지 견본에 있는 두뇌 견본 같이 높게 호스트 오염한 견본 모형에서 전체 길이 USUV 게놈의 복구를 허용합니다. 앰플리코 기반 시퀀싱 접근법의 장점은 메타게노믹 시퀀싱및 더 높은 특이성에 비해 더 높은 민감도입니다. amplicon 기반 접근법을 사용하는 제한사항은 모든 균주에 맞는 프라이머를 설계하기 위해 서열이 유사해야 하며 프라이머는 바이러스 다양성에 대한 현재 의 지식에 따라 설계된다는 것입니다.
3세대 염기서열 분석의 지속적인 발전 과 개선을 감안할 때, 시퀀서의 오차율을 정기적으로 평가할 필요가 있다. 여기서, USUV를 이용한 일루미나 시퀀싱에 대해 나노기공의 성능을 직접 평가하는 방법을 일례로 설명한다. 이 방법은 최신 R10 플로우 셀로 생성된 시퀀스에 적용되며 베이스콜링은 최신 버전의 플립플롭 베이스콜러로 수행됩니다.
나노기공 시퀀싱은 지속적으로 진화하고 있으므로 오류율을 모니터링하는 방법에 대한 필요성이 있습니다. 여기서, 나노기공 시퀀서의 오차율을 모니터링하는 워크플로우에 대해 설명한다. 이 기능은 새 흐름 셀을 릴리스한 후 또는 basecalling의 새 릴리스가 릴리스된 경우에 유용할 수 있습니다. 그러나 이 기능은 자체 시퀀싱 프로토콜을 설정하고 유효성을 검사하려는 사용자에게도 유용할 수 있습니다.
다른 소프트웨어 및 정렬 도구는 다른 결과를 얻을 수 있습니다33. 이 원고에서는 일반적으로 사용되고 명확한 설명서가 있는 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 패키지를 사용하는 것을 목표로 했습니다. 경우에 따라 일반적으로 사용자 친화적인 인터페이스를 가지고 있지만 비용을 지불해야 하는 상용 도구에 기본 설정이 제공될 수 있습니다. 미래에, 이 방법은 시퀀스 기술 또는 베이스 콜링 소프트웨어의 큰 수정이 도입되는 경우 동일한 샘플에 적용될 수 있으며, 기본 호출기 또는 플로셀의 각 업데이트 후에 이 작업을 수행해야 하지만 현재 개발 속도를 감안할 때 주요 업데이트 후에만 수행될 수 있습니다.
시퀀싱에서 오류율이 감소하면 더 많은 수의 샘플이 다중화될 수 있습니다. 이에 따라 나노기공 시퀀싱은 진단 분석용 종래의 실시간 PCR을 대체하는 것에 가까워지고 있으며, 이는 이미 인플루엔자 바이러스 진단의 경우이다. 또한 오류율이 감소하면 사소한 변이체의 결정 및 고처리량의 편향되지 않은 메타게놈 시퀀싱과 같은 이 기법의 시퀀싱의 유용성이 증가합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 신뢰할 수 있는 신뢰할 수 있는 참조 시퀀스를 사용할 수 있어야 한다는 것입니다. 프라이머는 바이러스 다양성에 대한 현재의 지식을 기반으로하며 가끔씩 업데이트해야 할 수도 있습니다. 앰플리코 기반 시퀀싱 방식을 설정할 때 또 다른 중요한 점은 앰플리톤 깊이에서 균일한 균형을 얻기 위해 프라이머 농도의 균형입니다. 이를 통해 시퀀스 실행에 더 많은 샘플을 다중화할 수 있으며 상당한 비용 절감을 달성합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 보조금 협정 No. 643476 (비교)에 따라 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았다.
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
dNTPs | Qiagen | 201900 | |
FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
Random Primers | Promega | C1181 | |
RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |