Her karakteriserer vi proteinstruktur og interaksjonssteder i levende celler ved hjelp av en proteinfotavtrykksteknikk kalt in-cell rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (IC-FPOP).
Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en hydroksylradikal proteinfotavtrykksmetode som brukes til å karakterisere proteinstruktur og interaksjoner. FPOP bruker en 248 nm excimer laser for å fotolyserhydrogenperoksid som produserer hydroksylradikaler. Disse radikaleroksidativt endre løsemiddel eksponert sidekjeder av 19 av de 20 aminosyrene. Nylig har denne metoden blitt brukt i levende celler (IC-FPOP) for å studere proteininteraksjoner i sitt eget miljø. Studien av proteiner i celler står for intermolekylær trengsel og ulike proteininteraksjoner som er forstyrret for in vitro studier. Et tilpasset enkeltcelleflytsystem ble utformet for å redusere celleaggregasjon og tilstopping under IC-FPOP. Dette strømningssystemet fokuserer cellene forbi den excimer laser individuelt, og dermed sikre konsekvent bestråling. Ved å sammenligne omfanget av oksidasjon produsert fra FPOP til proteinets løsningsmiddel tilgjengelighet beregnet fra en krystallstruktur, IC-FPOP kan nøyaktig undersøke løsemiddel tilgjengelige sidekjeder av proteiner.
Hydrokylradikal proteinfotavtrykk (HRPF) er en metode som undersøker løsemiddeltilgjengeligheten til et protein gjennom kovalente modifikasjoner produsert av hydroksylradikaler. Når proteinstruktur eller proteininteraksjoner endres, vil det endre løsemiddeleksponeringen av aminosyrer, og dermed endre omfanget av modifikasjon av rester. Med HRPF har proteininteraksjoner1,,2,3 og proteinkonformasjonsendringer4,5,6 med hell blitt forhørt in vitro. Det finnes flere metoder som genererer hydroksylradikaler for HRPF-eksperimenter, en er rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP). FPOP ble utviklet av Hambly og Gross i 2005 og benytter en 248 nm excimer laser for å produsere hydroksylradikaler gjennom fotolysen av hydrogenperoksid (H2O2)7.
Nylig utvidet Espino et al. bruken av FPOP til å sonde proteinstruktur i levende celler, en metode kalt in-cell FPOP (IC-FPOP)8. I motsetning til in vitro studier, studere proteiner i celler står for molekylær trengsel sammen med ulike protein interaksjoner som potensielt kan påvirke strukturen. I tillegg presenterer det fordelen av å gi et øyeblikksbilde av hele proteomet som potensielt gir strukturell informasjon om mange systemer samtidig for å utføre proteome bred strukturell biologi. Videre er denne teknikken ideell for proteiner som er vanskelige å studere in vitro, som membranproteiner.
Innledende studier av IC-FPOP vellykket undersøkt 105 proteiner som spenner i protein overflod og cellulær lokalisering. For å forbedre IC-FPOP-metoden utviklet Rinas et al. et mikrostrømssystem for encellestrøm9. Forbedringen av det opprinnelige strømningssystemet begrenser celleaggregering og øker tilgjengelig E2O2 tilgjengelig for bestråling. I det første strømningssystemet resulterte celler som klumpet seg i silikaslangen, i tresko og ujevn bestråling. Inkorporeringen av to strømmer av en kappebuffer fokuserer hydrodynamisk cellene, slik at de kan strømme individuelt forbi laseren. Inkorporering av en separat sprøyte for H2O2 muliggjør mer kontrollert og optimal eksponeringstid som gir høyere H2O2 konsentrasjoner uten bivirkninger. Også begrense inkubasjonstiden begrenser nedbrytningen av H2O2 ved endogene catalase. Ved å innlemme dette nye strømningssystemet økte det oppdagede antallet proteiner med en FPOP-modifikasjon 13 ganger, og utvider dermed egenskapene til denne metoden for å undersøke en rekke proteiner i levende celler. I denne protokollen er et generelt IC-FPOP-eksperiment beskrevet med fokus på monteringen av IC-FPOP-strømningssystemet.
Flere massespektromebaserte teknikker er utviklet for å studere proteinstruktur og protein-ligand komplekser på en proteome-wide måte i hele celler eller celle lysates. Disse teknikkene inkluderer, men er ikke begrenset til stabilitet av proteiner fra oksidasjonshastigheten (SPROX), termisk proteomprofilering (TPP), kjemisk krysskobling (XL-MS) og hydroksylradikal proteinfotavtrykk (HRPF). Hver teknikk har unike begrensninger og fordeler i forhold til hverandre, som har blitt grundig gjennomgått12. Hver av disse metodene har blitt brukt til proteome bred strukturell biologi for å belyse proteinstruktur og til slutt fungere innenfor det komplekse cellulære miljøet. IC-FPOP er en HRPF-teknikk som benytter hydroksylradikaler til å oksidativt modifisere løsemiddeleksponerte sidekjeder av aminosyrer, sondering av proteinstruktur og proteinligog interaksjoner i levedyktige celler13. IC-FPOP er en forbedring av første HRPF i levende celler som brukte Fenton kjemi for å generere radikaler på minutter tidsskala14. I denne studien ble strukturelle endringer i et integrert membranprotein som svar på å senke pH eller ionisk styrke av bufferen med hell preget med god oksidasjonsdekning på tvers av proteinet. Sammenlignet med Fentonkjemi er IC-FPOP mye raskere, og endrer proteiner på mikrosekundtidsskalaen, slik at den innfødte proteinkonformasjonen kan studeres.
En viktig test for IC-FPOP er å bekrefte levedyktigheten til cellene etter eksponering for H2O2. Ved hjelp av en 40 cm blandelinje inkuberes cellene i H2O2 for omtrent 3 s før bestråling. Denne gangen kan justeres ved å endre lengden på denne silikaslangen. Det er bemerkelsesverdig at selv om bruk av trypan blå for å teste celle levedyktighet viser integriteten til cellene opprettholdes etter H2O2 inkubasjon, cellene kan potensiale være under stress effekt signalering veier som samhandler med H2O2. Heldigvis er den korte inkubasjonstiden raskere enn proteinsyntese som gir tillit til at proteinene som er tilstede, ikke induseres av H2O2.
Det neste viktige trinnet er å bekrefte riktig montering av strømningssystemet. Når det er montert, må du sørge for at det ikke finnes noen lekkasjer etter at systemet er spylet med ønsket buffer. Hvis det er lekkasjer, må du kontrollere at silikaslangen ble kuttet riktig og er i flukt mot ferrule for å lage en skikkelig forsegling når den er strammet ned. Alle deler er håndstrammet, så det er ikke nødvendig med verktøy. Under hvert IC-FPOP-eksperiment må du kontrollere at de magnetiske rørerne i cellesprøyten forblir i bevegelse. Denne lille agitasjonen begrenser antall celler som bosetter seg nederst i sprøyten, men som ikke er harde nok til å skjære cellene. Etter ett løp er det omtrent 50 μL celler igjen i sprøyten. Sørg alltid for å fortynne dette med et snertrinn for å begrense antall celler som overføres til neste eksperiment. Det anbefales å bruke en fersk cellesprøyte hvis flere cellebehandlinger sammenlignes. Det er også viktig å velge en passende buffer for cellene som testes. Noen buffere slukker hydroksylradikaleren som fører til færre modifikasjoner på proteiner. Xu et al. har vist at noen vanlige buffere reduserer hydroksylradikal levetid11. DPBS og HBSS er vanlige buffere som brukes for IC-FPOP-eksperimenter.
Etter IC-FPOP optimaliserer du fordøyelsesprotokollen basert på parameterne som trengs. Siden FPOP produserer irreversible kovalente modifikasjoner, er det god tid tilgjengelig for en grundig fordøyelse og opprydding uten å miste merkingsdekningen. Test og normaliser proteinkonsentrasjonen slik at ensartede peptidkonsentrasjoner lastes for tandemmassespektrometri. Til slutt, vær oppmerksom på at en immunnedbør ikke kan utføres i forbindelse med IC-FPOP. Hvis en FPOP-modifikasjon retter seg mot interaksjonsområdet, senkes affiniteten til antistoffet. For å øke identifiseringen av FPOP modifikasjoner, 2D-kromatografiske separasjontrinn har vist seg å mer enn tredoble antall oksiderte peptider oppdaget15.
En utfordring med ethvert FPOP-eksperiment er det kompliserte nivået av dataanalyse på grunn av mulige oksidasjonsprodukter som kan oppstå. Dette gjelder for både in-cell eller in vitro, men er drastisk økt med den ekstra kompleksiteten ved å analysere cellelysates. Med ytterligere optimalisering av IC-FPOP oppstår flere proteiner med høyere modifikasjonsdekning, og dermed raskt gjør analysen mer krevende. Skjærmengden data generert fra et enkelt IC-FPOP-eksperiment begrenser bruken av manuell validering som får forskerne til å stole tyngre på programvare. På grunn av dette utviklet Rinas et al. en kvantitetsstrategi for HRPF ved hjelp av Proteome Discoverer (PD)16. Denne metoden bruker en arbeidsflyt for flersøksnode på PD kombinert med en kvantitativ plattform i et regneark. Ytterligere forbedringer på IC-FPOP-plattformen er i gang for å øke antall identifiserte peptider med FPOP-modifikasjoner sammen med økt reproduserbarhet og kvantitetsnøyaktighet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NSF CAREER Award (MCB1701692) for LMJ.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |