Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente
Summary
Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.
Abstract
Im zentralen Nervensystem sind Oligodendrozyten für ihre Rolle bei der Axonmyelination bekannt, die die Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung beschleunigt. Darüber hinaus deuten immer mehr Berichte darauf hin, dass Oligodendrozyten mit Neuronen jenseits der Myelinisierung interagieren, insbesondere durch die Sekretion von löslichen Faktoren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung von oligodendroglialen Linienzellen aus Gliazellkulturen ermöglicht, die auch Astrozyten und mikrogliaale Zellen enthalten. Die Methode beruht auf dem nächtlichen Schütteln bei 37 °C, das eine selektive Ablösung der darüber liegenden Oligodendroglialzellen und Mikrogliazellen ermöglicht, und der Eliminierung von Mikroglia durch Differentialhaftung. Wir beschreiben dann die Kultur der Oligodendrozyten und die Produktion von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium (OCM). Wir bieten auch die Kinetik der OCM-Behandlung oder Oligodendrozyten Zusätzlich zu gereinigten Hippocampus-Neuronen in Co-Kultur-Experimente, Studium der Oligodendrozyten-Neuron-Wechselwirkungen.
Introduction
Oligodendrozyten (OLs) sind Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS), die Myelin um Axone herum umwickeln. OLs stammen von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), die sich innerhalb der ventrikulären Zonen des embryonalen ZNS vermehren und dann in vollausgereifte OLs (d.h. Myelin-bildende Zellen) migrieren und differenzieren1. OPCs sind während der frühen Entwicklung reichlich vorhanden, aber auch im erwachsenen Gehirn bestehen, wo sie die haupthäufigste proliferative Zellpopulation darstellen2. Ein einzelnes OL verschließt mehrere Axone in nicht erregbaren Abschnitten (d. h. Internodien), und der Rand jeder Myelinschleife wird an dem Axon befestigt, der die paranodale Domäne bildet, die für die isolierenden Eigenschaften von Myelin1,3entscheidend ist. Zwischen den Paranoden befinden sich kleine, unmyelinierte Lücken, die als Knoten von Ranvier bezeichnet werden. Diese Knoten sind reich an spannungsgebundenen Natriumkanälen (Nav), was die Regeneration und schnelle Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung4ermöglicht. Diese enge Wechselwirkung ermöglicht auch axonale Energieunterstützung durch neuronale Aufnahme von Laktat aus OLs5,6.
Die Reifung von oligodendroglialen Abstammungszellen und der Myelinisierungsprozess werden durch ihre Wechselwirkungen mit Neuronen streng reguliert7. Tatsächlich exprimieren OLs und OPCs, auch NG2-Zellen genannt, eine Reihe von Rezeptoren für Neurotransmitter und können Input von exzitatorischen und hemmenden Neuronen erhalten, so dass sie neuronale Aktivität spüren können, die ihre Proliferation und/oder Differenzierung in myelinierenden Zellen auslösen kann2. OPCs/OLs wiederum sezernieren Mikrovesikund und Proteine in den extrazellulären Raum, der allein oder synergistisch neuromodulative und neuroprotektive Funktionen8,9,10,11,12. Die molekularen Mechanismen, die die verschiedenen Arten von Wechselwirkungen zwischen oligodendroglialen Abstammungszellen und Neuronen steuern, müssen jedoch noch vollständig entschlüsselt werden.
Darüber hinaus sind oLs in mehreren zNS-pathologischen Erkrankungen in erster Linie betroffen und stören so ihre Interaktion mit Neuronen. Zum Beispiel, bei Multipler Sklerose (MS), neurologische Dysfunktion wird durch fokale Demyelination im ZNS verursacht, sekundär zu OLs Verlust, der zu axonalen Schäden und damit verbundenen Behinderung Akkumulation führen kann. Eine Remyelination kann stattfinden, wenn auch in den meisten Fällen nicht ausreichend13. Fortschritte in den letzten zehn Jahren aufgrund der Entwicklung von Immuntherapien haben die Rückfallrate reduziert, aber die Förderung der Remyelination bleibt bis heute ein unerfülltes Bedürfnis. Daher ist ein besseres Verständnis der Rolle, Funktionen und Einflüsse von OLs für die Entwicklung neuer Therapien für ein breites Spektrum von ZNS-Bedingungen von besonderem Interesse.
Hier beschreiben wir die Methoden der OLs Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht eine genaue Untersuchung der intrinsischen Mechanismen, die ihre Entwicklung und Biologie regulieren. Darüber hinaus ermöglichen solche hoch angereicherten OLs-Kulturen die Produktion von oligodendrozyten-konditionierten Medien (OCM), die gereinigten Neuronenkulturen hinzugefügt werden können, um Einblicke in die Auswirkungen von OLs-sekretionierten Faktoren auf die neuronale Physiologie und Konnektivität zu gewinnen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie ein In-vitro-Kokultursystem implementiert wird, in dem gereinigte Oligodendrozyten und Neuronen miteinander kombiniert werden, so dass die Mechanismen, die die (Re-)Myelinisierung regulieren, angegangen werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um hoch angereicherte oligodendrogliale Linienzellkulturen aus gemischten Gliakulturen zu erhalten, angepasst an eine zuvor veröffentlichte Methode16, und die anschließende Produktion von OL-konditioniertem Medium. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer, kann dreimal wiederholt werden und ist optimal, um eine hohe Menge an gereinigten OLs zu erhalten, da Zellen, die in Bottenstein-Sato (BS) Medium kultiviert werden, das PDGF-Vermehrung…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Rémi Ronzano für seinen klugen Rat in der Manuskriptbearbeitung. Diese Arbeit wurde durch ICM, INSERM, ARSEP Stiftung Zuschuss an NSF und Bouvet-Labruyére Preis finanziert.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
Referências
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