Generasjon oligodendrocytes og oligodendrocyte-conditioned medium for co-kultur eksperimenter
Summary
Her viser vi en effektiv metode for rensing av oligodendrocytes og produksjon av oligodendrocyte-betinget medium som kan brukes til co-kultur eksperimenter.
Abstract
I sentralnervesystemet er oligodendrocytes kjent for sin rolle i aksonmyelinasjon, som akselererer forplantningen av handlingspotensialer gjennom saltatorisk ledning. Videre tyder et økende antall rapporter på at oligodendrocytes samhandler med nevroner utover myelinisering, spesielt gjennom sekresjon av løselige faktorer. Her presenterer vi en detaljert protokoll som tillater rensing av oligodendroglial avstamningceller fra glialcellekulturer som også inneholder astrocytter og mikroglialceller. Metoden er avhengig av at natten rister ved 37 °C, noe som gjør det mulig å selektiv løsrivelse av de overliggende oligodendroglialcellene og mikroglialceller, og eliminering av mikroglia ved differensial ved hedhesjon. Vi beskriver deretter kulturen til oligodendrocytes og produksjon av oligodendrocyte-betinget medium (OCM). Vi gir også kinetikken til OCM-behandling eller oligodendrocytes tillegg til renset hippocampal nevroner i co-kultur eksperimenter, studere oligodendrocyte-neuron interaksjoner.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) er glial celler i sentralnervesystemet (CNS) som genererer myelin innpakning rundt aksoner. OLs stammer fra oligodendrocyte forløperceller (OPCs) som sprer seg innenfor ventrikulære soner av embryonale CNS og deretter migrere og differensiere til fullt modne OLs (dvs. myelindannende celler)1. OPCs er rikelig under tidlig utvikling, men også vedvarer i den voksne hjernen hvor de representerer den store proliferative cellepopulasjonen2. En enkelt OL omslutter flere aksoner i ikke-spennende seksjoner (dvs. internoder), og kanten av hver myelinsløyfe festes til aksonen som danner paranodaldomenet som er avgjørende for de isolerende egenskapene til myelin1,3. Mellom paranodene er små umyelinerte hull kalt noder av Ranvier. Disse nodene er rike på spenningsinngjerdede natriumkanaler (Nav), slik at regenerering og rask forplantning av handlingspotensialer gjennom saltatorisk ledning4. Denne tette interaksjonen muliggjør også axonal energistøtte gjennom nevronal opptak av laktat fra OLs5,6.
Modningen av oligodendroglial avstamning celler og myelinisering sprosessen er tett regulert av deres interaksjoner med nevroner7. Faktisk, OLs og OPCs, også kalt NG2 celler, uttrykke en rekke reseptorer for nevrotransmittere, og kan motta innspill fra spennende og hemmende nevroner, slik at de kan føle nevronal aktivitet som kan utløse deres spredning og / eller differensiering i myeliniserende celler2. I sin tur utskiller OPCer / OLs mikrovesikler og proteiner inn i det ekstracellulære rommet som alene eller synergististisk medierer nevromodulative og nevrobeskyttende funksjoner8,9,10,11,12. Imidlertid er de molekylære mekanismene som kontrollerer flere moduser for interaksjoner mellom oligodendroglial avstamningceller og nevroner ennå ikke fullstendig dechiffrert.
Videre, i flere CNS patologiske forhold, påvirkes OLs først og fremst, og forstyrrer dermed deres interaksjon med nevroner. For eksempel, i multippel sklerose (MS), er nevrologisk dysfunksjon forårsaket av fokal demyelinasjon i CNS, sekundært til OLs tap som kan føre til aksonal skade og relatert uførhet akkumulering. Remyelinasjon kan finne sted, om enn utilstrekkelig i de fleste tilfeller13. Fremgang i det siste tiåret, på grunn av utviklingen av immunterapier, har redusert tilbakefallsraten, men fremme remyelinasjon forblir til dags dato et udekket behov. Som sådan er en bedre forståelse av OLs rolle, funksjoner og påvirkninger av særlig interesse for utvikling av nye terapier for et bredt spekter av CNS-forhold.
Her beskriver vi metodene for OLs rensing og kultur. Dette muliggjør presis undersøkelse av iboende mekanismer som regulerer deres utvikling og biologi. I tillegg tillater slike svært berikede OLs kulturer produksjonen av oligodendrocyte-betinget medium (OCM), som kan legges til rensede nevronkulturer for å få innsikt i virkningen av OLs-utskillede faktorer på nevronal fysiologi og tilkobling. Videre beskriver vi hvordan man implementerer et in vitro co-kultursystem der rensede oligodendrocytes og nevroner kombineres sammen, slik at de kan håndtere mekanismene som regulerer (re)myelinasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her gir vi en detaljert protokoll for å oppnå svært berikede oligodendroglial avstamning cellekulturer fra blandede glial kulturer, tilpasset fra en tidligere publisert metode16,og den påfølgende produksjonen av OL-betinget medium. Denne risting teknikken er ikke dyrt, kan gjentas tre ganger og er optimal for å oppnå høy mengde rensede OLs, som celler dyrket i Bottenstein-Sato (BS) medium som inneholder PDGFα spredning. Glialceller er utarbeidet ved hjelp av cerebrale kortices av Wistar r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Rémi Ronzano for hans kloke råd i manuskriptredigering. Dette arbeidet ble finansiert av ICM, INSERM, ARSEP foundation tilskudd til NSF, og Bouvet-Labruyère pris.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
Referências
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
