Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura
Summary
Aqui, apresentamos um método eficiente para a purificação de oligodendrocytes e produção de meio condicioso oligodendrocyte que pode ser usado para experimentos de cocultura.
Abstract
No sistema nervoso central, os oligodendrocytes são bem conhecidos por seu papel na mielinação de axon, que acelera a propagação de potenciais de ação através da condução saltatória. Além disso, um número crescente de relatórios sugere que os oligodendrocitos interagem com neurônios além da mielinização, notadamente através da secreção de fatores solúveis. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite a purificação de células de linhagem oligodendroglial de culturas células gliais também contendo astrócitos e células microgliais. O método conta com tremores noturnos a 37 °C, o que permite o desprendimento seletivo das células oligodendrólais e células microgliais, e a eliminação da microglia por adesão diferencial. Descrevemos então a cultura dos oligodendrocytes e a produção de meio climatizado pelo oligodendrocyte (OCM). Também fornecemos as cinéticas do tratamento oCM ou oligodendrocytes, além de neurônios hipocampais purificados em experimentos de cocultura, estudando interações oligodendrocyte-neurônio.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) são células gliais do sistema nervoso central (CNS) que geram embalagem de mielina em torno de axônios. Os OLs são originários de células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) que proliferam dentro das zonas ventriculares do CNS embrionário e depois migram e se diferenciam em OLs totalmente maduros (ou seja, células formadoras de mielina)1. Os OPCs são abundantes durante o desenvolvimento precoce, mas também persistem no cérebro adulto, onde representam a maior população de células proliferativas2. Um único OL enshea vários axônios em seções não excitáveis (ou seja, internodes), e a borda de cada alça de mielina se conecta ao axônio formando o domínio paranodal que é crucial para as propriedades isolantes da mielina1,3. Entre os desfiles estão pequenas lacunas immielinizadas chamadas os nós de Ranvier. Esses nós são ricos em canais de sódio fechados por tensão (Nav), permitindo a regeneração e rápida propagação de potenciais de ação através da condução saltatória4. Essa interação apertada também permite o suporte à energia axonal através da captação neuronal de lactato de OLs5,6.
O amadurecimento das células de linhagem oligodendroglial e o processo de mielinação são fortemente regulados por suas interações com neurônios7. De fato, OLs e OPCs, também chamados de células NG2, expressam uma série de receptores para neurotransmissores, e podem receber entrada de neurônios excitatórios e inibitórios, permitindo que eles detectem atividade neuronal que pode desencadear sua proliferação e/ou diferenciação em células mielinantes2. Por sua vez, opcs/OLs secretam microvesicles e proteínas no espaço extracelular que sozinho ou sinergicamente mediam funções neuromodulativas e neuroprotetoras8,9,10,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares que controlam os múltiplos modos de interações entre células de linhagem oligodendroglial e neurônios ainda não foram totalmente decifrados.
Além disso, em várias condições patológicas do CNS, os OLs são afetados principalmente, perturbando assim sua interação com os neurônios. Por exemplo, na Esclerose Múltipla (EM), a disfunção neurológica é causada pela desmistelinação focal no CNS, secundária à perda de OLs que pode levar a danos axonais e acúmulo de incapacidade relacionada. A remielinização pode ocorrer, embora insuficientemente na maioria dos casos13. O progresso na última década, devido ao desenvolvimento de imunoterapias, reduziram a taxa de recaída, mas promover a remielinização permanece até o momento uma necessidade não atendida. Como tal, uma melhor compreensão do papel, funções e influências das OLs é de particular interesse para o desenvolvimento de novas terapias para um amplo espectro de condições de CNS.
Aqui, descrevemos os métodos de purificação e cultura das OLs. Isso permite o exame preciso de mecanismos intrínsecos que regulam seu desenvolvimento e biologia. Além disso, tais culturas altamente enriquecidas de OLs permitem a produção de meio com condições de oligodendrocito (OCM), que pode ser adicionado às culturas de neurônios purificados para obter uma visão do impacto de fatores secretos do OLs na fisiologia neuronal e conectividade. Além disso, descrevemos como implementar um sistema de co-cultura in vitro onde oligodendrocitos purificados e neurônios são combinados, permitindo abordar os mecanismos que regulam (re)mielinação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para obter culturas de linhagem oligodendroglial altamente enriquecidas a partir de culturas gliais mistas, adaptadas de um método16publicado anteriormente , e a produção subsequente de meio sedél condicionado. Esta técnica de agitação não é cara, pode ser repetida três vezes e é ideal para obter alta quantidade de OLs purificados, como células cultivadas em bottenstein-Sato (BS) meio contendo PDGFα proliferam. As células gliais são preparadas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Rémi Ronzano por seu sábio conselho na edição de manuscritos. Este trabalho foi financiado pelo ICM, INSERM, bolsa de fundação ARSEP à NSF e preço bouvet-labruyère.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
Referências
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