Generation oligodendrocyter och Oligodendrocyte-Konditionerat medium för samkulturexperiment
Summary
Häri visar vi en effektiv metod för rening av oligodendrocyter och produktion av oligodendrocyte-konditionerat medium som kan användas för samkulturexperiment.
Abstract
I det centrala nervsystemet är oligodendrocyter kända för sin roll i axonmyelination, som påskyndar spridningen av åtgärder potentialer genom saltatory resistiv. Dessutom tyder ett ökande antal rapporter på att oligodendrocyter interagerar med nervceller bortom myelination, särskilt genom utsöndringen av lösliga faktorer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som tillåter rening av oligodendroglial härstamning celler från gliaceller kulturer som också innehåller astrocyter och mikrogliala celler. Metoden bygger på att över natten skaka vid 37 °C, vilket möjliggör selektiv avskildhet av de överliggande oligodendroglialcellerna och mikrogliacellerna, och eliminering av mikroglia genom differentialvidhäftning. Vi beskriver sedan kulturen av oligodendrocyter och produktion av oligodendrocyte-konditionerat medium (OCM). Vi tillhandahåller också kinetik av OCM behandling eller oligodendrocytes tillägg till renade hippocampus nervceller i co-kultur experiment, studera oligodendrocyte-neuron interaktioner.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) är gliaceller i centrala nervsystemet (CNS) som genererar myelin inslagning runt axoner. Oem-filer härstammar från oligodendrocyte prekursorceller (OPCs) som förökar sig inom ventrikulärt zoner i embryonala CNS och sedan migrera och differentiera till helt mogna OP (dvs. myelinbildande celler)1. Opcs är rikliga under tidig utveckling, men också kvarstår i den vuxna hjärnan där de representerar den stora proliferativecellpopulationen 2. En enda OL ensheathes flera axoner i icke-retbara sektioner (dvs. internoder), och kanten på varje myelin slinga fäster vid axon bildar paranodal domän som är avgörande för isolerande egenskaper myelin1,3. Mellan paranoderna finns små omyelinerade luckor som kallas noderna i Ranvier. Dessa noder är rika på spänningsgated natriumkanaler (Nav), vilket möjliggör regenerering och snabb spridning av åtgärder potentialer genom saltatory conduction4. Denna snäva interaktion möjliggör också axonal energi stöd genom neuronal upptag av laktat från OLs5,6.
Mognaden av oligodendroglial härstamning celler och myelinationprocessen är tätt regleras av deras interaktioner med nervceller7. Faktum är att OPOch och OPCs, även namngivna NG2-celler, uttrycka en rad receptorer för signalsubstanser, och kan få input från excitatoriska och hämmande nervceller, så att de kan känna neuronal aktivitet som kan utlösa deras spridning och / eller differentiering i myelinating celler2. I sin tur utsöndrar OPCs/OLs mikrovesicles och proteiner i det extracellulära utrymmet som ensam eller synergistiskt medla neuromodulativa och nervskyddande funktioner8,9,10,11,12. Emellertid, de molekylära mekanismer som styr flera typer av interaktioner mellan oligodendroglial härstamning celler och nervceller är ännu inte helt dechiffreras.
Dessutom, i flera CNS patologiska tillstånd, OEM påverkas främst, vilket stör deras interaktion med nervceller. Till exempel, i multipel skleros (MS), neurologisk dysfunktion orsakas av fokal demyelination i CNS, sekundär till OLs förlust som kan leda till axonal skada och relaterade funktionshinder ackumulering. Remyelination kan ske, om än inte tillräckligt i de flesta fall13. Framsteg under det senaste årtiondet, på grund av utvecklingen av immunterapier, har minskat återfallsfrekvensen, men att främja remyelination är hittills ett otillfredsställt behov. Som sådan är en bättre förståelse av OEM-faktorer, funktioner och influenser av särskilt intresse för utvecklingen av nya terapier för ett brett spektrum av CNS-villkor.
Här beskriver vi metoderna för ATT förena och kultur. Detta möjliggör exakt undersökning av inneboende mekanismer som reglerar deras utveckling och biologi. Dessutom tillåter sådana starkt berikade OEM-kulturer produktionen av oligodendrocyte-konditionerat medium (OCM), som kan läggas till renade neuronkulturer för att få insikt i effekterna av OLs-utsöndrade faktorer på neuronal fysiologi och anslutning. Dessutom beskriver vi hur man genomför ett in vitro-samkultursystem där renade oligodendrocyter och nervceller kombineras tillsammans, vilket gör det möjligt att ta itu med de mekanismer som reglerar (re)myelination.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ger vi ett detaljerat protokoll för att få mycket berikade oligodendroglial härstamning cellkulturer från blandade gliakulturer, anpassade från en tidigare publicerad metod16, och den efterföljande produktionen av OL-konditionerade medium. Denna skakteknik är inte dyr, kan upprepas tre gånger och är optimal för att få hög mängd renade OLs, som celler odlade i Bottenstein-Sato (BS) medium som innehåller PDGFα föröka sig. Gliaceller framställs med hjälp av cerebrala kortitete…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Rémi Ronzano för hans kloka råd i manuskriptredigering. Detta arbete finansierades av ICM, INSERM, ARSEP stiftelse bidrag till NSF, och Bouvet-Labruyère pris.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
Referências
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
