Поколение человека iPSC основе крови мозга барьер чип
Summary
Гематоэнцефалический барьер (BBB) является многоклеточным нервно-сосудистым подразделением, плотно регулирующим гомеостаз мозга. Объединив iPSCs человека и технологии органа на чипе, мы создали персонализированный чип BBB, пригодный для моделирования заболеваний и прогнозов проницаемости лекарств CnS. Подробный протокол описан для генерации и эксплуатации чипа BBB.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (BBB) формируется нервно-сосудистыми подразделениями (НВУ), которые защищают центральную нервную систему (ЦНС) от целого ряда факторов, обнаруженных в крови, которые могут нарушить тонкую функцию мозга. Таким образом, BBB является основным препятствием для доставки терапевтических препаратов для ЦНС. Накопленные данные свидетельствуют о том, что BBB играет ключевую роль в начале и прогрессировании неврологических заболеваний. Таким образом, существует огромная потребность в модели BBB, которая может предсказать проникновение cnS-целевых препаратов, а также прояснить роль BBB в области здравоохранения и болезней.
Недавно мы объединили технологии органов на чипе и индуцированных стволовых клеток (iPSC) для создания чипа BBB, полностью персонализированного для человека. Эта новая платформа отображает клеточные, молекулярные и физиологические свойства, которые подходят для прогнозирования транспортировки лекарств и молекул через человека BBB. Кроме того, используя специфические для пациента чипы BBB, мы создали модели неврологических заболеваний и продемонстрировали потенциал для персонализированного применения прогностической медицины. Приведенный здесь подробный протокол, демонстрирующий, как генерировать микросхемы BBB, полученные из iPSC, начиная с дифференциации микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, полученных iPSC (iBMECs) и в результате смешанных нейронных культур, содержащих нейронных прародителей, дифференцированных нейронов и астроцитов. Также описана процедура посева клеток в органный чип и культивирование чипов BBB под контролируемым ламинарным потоком. Наконец, приводятся подробные описания анализа чипов BBB, включая параклеточные анализы проницаемости для оценки проницаемости препарата и молекулы, а также иммуноцитохимические методы для определения состава типов клеток в чипе.
Introduction
BBB является очень селективным барьером, который отделяет ЦНС от циркулирующей крови. Он защищает критические функции мозга от потенциально разрушительных веществ, факторов и ксенобиотики, а также позволяет приток питательных веществ и других метаболитов, необходимых для поддержания гомеостаза мозга1. BBB является многоклеточным NVU, в котором перициты, астроциты endfeet, и нейронные процессы непосредственно контакт мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (BMECs). Эти взаимодействия позволяют BMECs формировать специализированные барьерные свойства, которые поддерживаются плотными и придерживает соединения2,3. Формирование этого барьера ограничивает параклеточный проход молекул, но содержит поляризованные транспортеры для активного переноса молекул в ЦНС или обратно в кровь1. Из-за этих уникальных барьерных свойств, BBB представляет собой серьезное препятствие для доставки биофармацевтических препаратов в мозг, и, по оценкам, менее 5% FDA утвержденных малых молекул может достичь ЦНС4.
Модели животных широко используются для изучения пенетранса BBB и молекулярных механизмов, участвующих в разработке BBB5. В то время как модели животных точно представляют собой сложную многоклеточную среду in vivo, различия в экспрессии и активности перевозчиков BBB, а также субстрата специфики между видами часто исключают точную экстраполяцию данных о животных на людей6. Таким образом, модели на основе человека имеют решающее значение для изучения БББ человека и для использования в разработке препаратов, предназначенных для целевой ЦНС. Эта необходимость становится еще более очевидной в связи с растущим доминированием биологических, специфических для человека препаратов в области фармацевтического развития. Накопление доказательств свидетельствует о том, что скомпрометированный BBB связан с рядом тяжелых заболеваний ЦНС, включая опухоли головного мозга и неврологические заболевания7,8,9. Человеческие модели, верой он ко мне, отражающие эти заболевания, могут идентифицировать как 1) определить новые пути, которые могут быть направлены на разработку лекарств, и 2) предсказывают пенетранс ЦНС, тем самым сокращая время и ресурсы в доклинических исследованиях и, возможно, уменьшая частоту отказов в клинических испытаниях.
Модели In vitro были широко реализованы для изучения взаимодействия между BMECs и другими клетками НВУ и проведения экранов для перспективных BBB-проницаемых препаратов10. Чтобы воссоздать ключевые аспекты человеческого BBB, модели in vitro должны отображать физиологически значимые свойства (т.е. низкую парацеллюлярную проницаемость и физиологически релевантную трансэндотелиальную электрическую устойчивость (TEER) через эндотелиальный монослой). Кроме того, молекулярный профиль системы in vitro должен включать экспрессию репрезентативных функциональных транспортных систем. Как правило, модели in vitro состоят из эндотелиальных клеток, которые совместно культивируются на полупроницаемой мембране с комбинациями других клеток НВУ для повышения свойств BBB11. Такой подход позволяет просто и относительно быстро оценить барьерную функциональность и проницаемость молекул. Такие модели BBB на основе клеток на основе клеток могут быть установлены с помощью животных или человеческих клеточных источников, включая клетки, изолированные от хирургических иссечений или увековеченные линии BMEC.
Недавно, протоколы для дифференцировать человека плюрипотентных клеток в BMECs были введены в качестве привлекательного источника для in vitro человека BBB модели12,13. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) полученные BMECs (iBMECs) являются высоко масштабируемыми, демонстрируют критические морфологические и функциональные характеристики человека BBB, и нести генетику пациента. В культуре iBMECs образуют монослой, который выражает плотные маркеры соединения и отображает в виво-подобных плотных комплексах соединения. Эти клетки также выражают маркеры BBB, в том числе транспортер глюкозы BBB, транспортер глюкозы 1 (GLUT1). Важно, и в отличие от других альтернативных источников клеток для человека BMECs, iBMECs приобрести барьерные свойства со значениями выше, чем те, измеряется в vivo14, поляризуйте вдоль базолатеральной оси, и выразить функциональные насосы efflux. Кроме того, использование iPSCs от различных предметов, как 1) приветствует возможность проверить аспекты BBB в персонализированной медицинской основе и 2) обеспечивает гибкий источник для генерации дополнительных типов клеток НВУ. Создание этих клеток из изогенного источника клеток для создания персонализированных чипов BBB также поможет в понимании межиндивидуальных различий в ответных мерах на наркотики, что является основной причиной устойчивости или скомпрометированной реакции на лечение, наблюдаемое в клинических исследованиях.
Использование iBMECs в качестве монослойных в блюде или на полупроницаемой вставке transwell представляет собой мощный подход для моделирования BBB. Эти системы, как правило, являются надежными, воспроизводимыми и рентабельными. Кроме того, функциональные анализы, такие как TEER и проницаемость относительно просты в выполнении. Тем не менее, двумерные (2D) системы не в состоянии резюмировать 3D характер ткани in vivo, и они не имеют физиологических сил сдвига стресса, предоставляемых циркулирующих крови и клеток крови. Это ограничивает способность сосудистого эндотелия в этих моделях развивать и поддерживать внутренние свойства и функции BBB.
Микроинженерные системы, выложенные живыми клетками, были внедрены для моделирования различных функциональных возможностей органов в концепции, называемой органом на чипах. Воссоздавая виво-подобную многоклеточную архитектуру, интерфейсы тканей и тканей, физико-химическую микросреду и сосудистую перфузию, эти микроинженерные платформы генерируют уровни ткани и функциональности органов, которые невозможны с обычные 2D системы культуры. Они также позволяют высокое разрешение, в режиме реального времени изображения, а также анализ биохимических, генетических и метаболических профилей похож на живые клетки в ткани in vivo и органа контексте. Тем не менее, особая проблема органа на чипе заключается в том, что проектирование, изготовление и применение этих микроинженерных чипов требует специализированных инженерных знаний, которые, как правило, не хватает в биологически ориентированных научных лабораторий.
Недавно мы объединили технологии iPSC и орган-на-чипе для создания персонализированной модели чипов BBB15,16. Для преодоления описанных технологических проблем коммерчески доступный Chip-S1 используется вместе с модулем культуры, инструментом, предназначенным для автоматизации обслуживания чипов простым и надежным способом (Emulate Inc.). Чип BBB воссоздает взаимодействия между нервными и эндотелиальными клетками и достигает физиологически значимых значений TEER, которые измеряются пользовательскими чипами органов с интегрированными золотыми электродами17. Кроме того, чип BBB отображает низкую параклеетальную проницаемость, реагирует на воспалительные сигналы на уровне органов, выражает активные насосы efflux и демонстрирует прогностический перенос растворимых биомаркеров и биофармацевтических препаратов. Примечательно, что чипы BBB, генерируемые из нескольких особей, фиксируют ожидаемые функциональные различия между здоровыми людьми и пациентами с неврологическими заболеваниями15.
В описанном ниже протоколе описывается надежный, эффективный и воспроизводимый метод генерации чипов BBB на основе iPSC в условиях динамического потока. Руководство предоставляется по типу анализов и анализа конечных точек, которые могут быть выполнены непосредственно в чипе BBB или из отбора сточных вод. Таким образом, протокол демонстрирует спектр методов, которые могут быть применены для оценки биологических и функциональных свойств и реакций в модели, соответствующей человеку.
Краткое описание чипа BBB на основе iPSC приведено здесь. IPSCs человека первоначально дифференцированы и распространяются в флягах культуры ткани как свободно плавающие агрегаты нейронных прародителей, называемых эквалайзер-сферы. Верхний канал Chip-S116,18,19 посеян с разрозненные эквалайзер-сферы, которые образуют “мозговой стороне” чипа, как клетки дифференцировать в течение 7 дней в смешанной культуре нейронных клеток-прародителей (iNPCs), iAstrocytes, и iNeurons. IPSCs человека также дифференцированы в плитах культуры ткани в iBMECs. Нижний канал чипа посеян с iBMECs для формирования “кровь стороны”, как они развиваются, чтобы сформировать эндотелиальную трубку (Рисунок 1). Пористая внеклеточная матрица (ECM) с покрытием мембрана, которая отделяет верхний и нижний каналы 1) позволяет образованию клеток к клетке взаимодействия между каналами и 2) позволяет пользователю запускать проницаемость анализов и изображений клеток в любом канале с помощью обычного светового микроскопа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сочетание технологии органа на чипе и iPSC-клеток в NVU обещает точное моделирование человека BBB. Здесь мы предоставляем подробный протокол для простого и надежного применения недавно опубликованного чипа BBB-16 на основе iPSC. Обзор и сроки парадигмы посева показаны на <strong class="xfig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сошану Свендсен за критический монтаж. Эта работа была поддержана ГрантОм Израильского научного фонда 1621/18, Министерством науки и техники (MOST), Израилем 3-15647, Калифорнийским институтом регенеративной медицины, грантом ID DISC1-08800, Фондом семьи Шерманов, грантом NIH-NINDS 1UG3NS105703 и грантом Ассоциации ALS 18-SI-389. AH финансировался Фондом Валленберга (грант No 2015.0178).
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
Referências
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington’s disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
