Здесь мы описываем иммунопрецициции рибосом и связанных с ними РНК из отдельных популяций взрослых мужских клеток зародышевой мыши с помощью системы RiboTag. Стратегическое размножение и тщательное иммунопрецициционное обеспечение приводят к чистым, воспроизводимым результатам, которые информируют о транслатоме зародышевых клеток и дают представление о механизмах фенотипов мутантов.
Количественная разница в изобилии мРНК является классическим подходом к пониманию влияния данной генной мутации на физиологию клеток. Однако, характеризующие различия в транслатоме (целом переведенных мРНК) обеспечивает дополнительный слой информации, особенно полезной при попытке понять функцию РНК регулирующих или связывающих белков. Для достижения этой цели был разработан ряд методов, включая рибосомное профилирование и полисомный анализ. Однако оба метода несут значительные технические проблемы и не могут быть применены к определенным популяциям клеток в ткани, если в сочетании с дополнительными методами сортировки. В отличие от этого, метод RiboTag является генетическим, эффективным и технически простой альтернативой, которая позволяет идентифицировать рибосомы связанных РНК из конкретных популяций клеток без дополнительных шагов сортировки, при условии, что применимый драйвер Cre для клеток имеется. Этот метод состоит из размножения для генерации генетических моделей, сбора образцов, иммунопрециционности и анализа РНК. Здесь мы излагаем этот процесс во взрослых мужских клетках зародышевых клеток мутант для РНК связывающий белок, необходимый для мужской плодовитости. Особое внимание уделяется вопросам селекции с акцентом на эффективное управление колониями и генерацию правильного генетического происхождения и иммунопреципции в целях снижения фона и оптимизации производства. Обсуждение вариантов устранения неполадок, дополнительных подтверждающих экспериментов и потенциальных приложений вниз по течению также включено. Представленные генетические инструменты и молекулярные протоколы представляют собой мощный способ описания рибосомных РНК конкретных клеточных популяций в сложных тканях или в системах с аномальным хранением мРНК и переводом с целью информирования о молекулярных драйверах фенотипов мутантов.
Анализ рнкона клетки или ткани, как и с помощью микроаррей или РНК-секвенирования, оказался мощным инструментом для понимания молекулярных драйверов фенотипов мутантов. Тем не менее, эти относительно неполные инструменты анализа не могут информировать о физиологии или протеоме клетки, особенно в системах, где многие мРНК хранятся до перевода, такие как нервные и зародышевые клетки. В этих системах определение популяции мРНК, активно переводимых в белок, или транслатом клетки, может быть лучшим показателем фактического физиологического состояния клетки1,2. Например, зародышевые клетки на различных стадиях разработки транскрибируют РНК, которые хранятся для последующего перевода, движимые либо развитием3, либо сигналами4. Этот процесс является примером мРНК кодирования протаминов, в котором транскрипт мРНК обнаруживается дней до белка производится1,2,5,6. Аналогичным образом, нервные клетки транскрибируют РНК в ядре и транспортируют ее вниз по аксону, как в случае с Q-actin7. В дополнение к этим специализированным клеточным системам, транскриптомы устойчивого состояния вряд ли будут информативными в моделях, где происходит хранение РНК, рибосомный биогенез или перевод мРНК. Несколько других факторов могут также повлиять на устойчивый состояние РНК пула клетки включают распад мРНК и активность РНК связывающих белков. В этих случаях надежные инструменты для анализа связанных с рибосомами РНК или мРНК при активном переводе с большей вероятностью дают биологически значимые результаты.
С этой целью было разработано несколько методов для выявления связанных с рибосомами или активно переведенных сообщений. Полисом профилирование, которое обеспечивает снимок рибосомы связанных стенограмм, был использован в течение многих десятилетий, чтобы изолировать нетронутыми РНК, связанных с либо рибосомных подразделений или моно-, ди-, и поли-рибосомы комплексов3. Кратко, собранные lysates клетки прикладываются к линейному градиенту сахарозы и центрифугированы как высокая скорость, приводящ к в разделении ингосомных subunits, неповрежденных ribosomes, и polysomes размером. Традиционно, этот метод был применен для изучения одного или нескольких мРНК, но в последнее время этот метод был объединен с РНК-сек исследований для выяснения функции потенциальных регуляторов переводов8,9 В то время как мощный способ различать активно преобразующих и не-преобразующих мРНК10, полисомное профилирование требует трудоемких методов (градиентов фракционное и ультрацентричная сделка) населения, сложное.
Альтернативным подходом к изучению транслатома является рибосомное профилирование, которое определяет части стенограмм, непосредственно связанных с рибосомой. Короче говоря, рибосомы связанные фрагменты РНК генерируются с помощью анализа защиты RNase, отдельные рибосомные комплексы, разделенные через градиент сахарозы, и связанные фрагменты РНК изолированы и преобразованы в РНК-сек теги поддаются глубокому секвенированию11. Одним из ключевых преимуществ рибосомного профилирования является возможность определить конкретные места рибосом во время изоляции, что позволяет идентифицировать места начала перевода, расчет рибосомной занятости и распределения, а также идентификацию рибосомных киосков12. Тем не менее, этот метод имеет несколько присущих недостатков, в том числе потребности в оборудовании (градиентный фракционный и ультрацентрифуг), относительно сложный протокол, который требует обширного устранения неполадок, и вычислительные проблемы не легко обрабатываются неопытным пользователем11. Важно отметить, что рибосомное профилирование в первую очередь применяется к изолированным клеткам в культуре и требует существенного материала, что делает его применение к смешанным тканям клеточного типа или отсортированным клеткам из in vivo ограниченным.
Метод млекопитающих RiboTag, разработанный Sanz et al. в 2009 году13,устраняет ряд проблем, присущих как полисомного, так и рибосомному профилированию. В этом методе, рибосомы связанных РНК могут быть изолированы от конкретных типов клеток, позволяющих для исследования клеточного типа конкретных транслатомов в сложных тканях без дополнительных методов изоляции и специализированного оборудования, как это необходимо в других методах13,14. Основой метода RiboTag является трансгенная модель мыши (RiboTag), несущая модифицированный локус для 60S рибосомного субъемаального белка гена Rpl22. Этот локус(Rpl22-HA) включает в себя флоксс терминал азон с последующим дополнительной копией терминала экзон с поправками, чтобы включить C-терминал гемагглютинин (HA) тег в области кодирования. При пересечении с мышью, выражающей клеточную cre Recombinase, флоксированный экзон удаляется, позволяя выражение HA-тегами RPL22 в клеточном порядке(рисунок 1). Тег HA может быть использован для иммунопреципитата (IP) рибосом и связанных с ними РНК из выбранного типа клеток.
В дополнение к первоначальной публикации, которая разработала метод, несколько других лабораторий использовали модель RiboTag. Разнообразные ткани, такие как мыши Sertoli и Leydig клетки15, микроглии16, нейроны17,18, ооциты19, и культивированные клетки20 были профилированы и изучены. Хотя этот протокол, безусловно, в состоянии успешно изолировать рибосомы и связанные с ними РНК через различные типы тканей Есть еще области, нуждающиеся в улучшении, особенно при применении к мутантным системам. В частности, общая зависимость от свежей ткани приводит к увеличению технических изменений, которые могут значительно уменьшить мощность анализа. Во-вторых, уверенная идентификация дифференциально переведенных целей становится более сложной, когда высокий фон иммунопреципиции происходит отне-Cre рекомбинированных типов клеток, как сообщалось ранее13. В то время как Sanz et al. спроектировали основную предпосылку метода, в этой рукописи лаборатория Снайдера представляет оптимизацию протокола, чтобы уменьшить эти проблемы, делая метод более практичным и эффективным.
Цель этой статьи состоит в том, чтобы объяснить шаги для разведения мышей, выражающих клеток конкретных HA-тегами рибосомы, иммуноподготовки этих рибосом от флэш-замороженных образцов, и очистка их связанных РНК для дальнейшего анализа вниз по течению. По мере того как mammalian мыжская клетка зародыша и изученная мутация неплодородности обеспечивают уникально возможности, усилия были сделаны для того чтобы осветить дороги этот метод можно приспособить к другим системам клетки.
Понимание транслатома определенного типа клеток имеет неоценимое значение для более точного понимания физиологии клетки в нормальном или мутантном состоянии. Особая польза наблюдается в системах, в которых перевод разъединяется от транскрипции, например, в нервной ткани, где перевод происходит очень далеко от транскрипции, или в зародышевых клетках, где транскрипция происходит задолго до перевода. По сравнению с другими методами анализа транслатомов, наибольшее преимущество системы RiboTag происходит от использования системы рекомбиназы Cre. Это позволяет свободно ориентироваться на любую популяцию клеток, которая имеет соответствующий драйвер Cre. Во-вторых, IIP RiboTag, как описано в настоящем документе, является эффективным и гораздо менее технически сложным и трудоемким, чем полисомного или рибосомное профилирование. Наконец, RiboTag IP может быть легко выполнена на скамейке.
В этом протоколе есть ряд важных шагов. Главным из них является создание линии мыши RiboTag и создание экспериментальных животных для изучения. Что касается всех генетических моделей, тщательное отслеживание лиц в колонии мыши, а также тщательного генотипирования протоколы должны быть применены. ПЦР генотипирования в соответствии с Sanz et al. должны включать в себя грунтовки ориентации loxP сайт 5′ из дикого типа экзон 4 различать wildtype аллелей (260 bp) и мутант (290 bp)13. Для анализа RiboTag в моделях зародышевых клеток следует соблюдать очень специфические требования к разведению. Во-первых, в случае мутантов, которые приводят к бесплодию, продуманные стратегии разведения должны включать методы оптимизации количества потомства с желаемым генотипом в промежуточных и экспериментальных поколениях. Во-вторых, в случае зародышевых клеток конкретных Cres, следует принимать меры в отношении Cre-zygosity учитывая чувствительность зародышевых клеток Cre токсичности. В зародышевой клетке, высокий уровень белка Cre может иметь вредные эффекты22, запрещая использование Cre / Cre животных в схеме размножения. Наконец, при использовании зародышевой клетки Cres, важно, чтобы изолировать аллель RiboTag от Cre до последнего поколения, как Cre выражение в зародышевой клетке промежуточного поколения приведет к потомству, выражая Rpl22-HA во всем мире.
Независимо от клеточной системы, ряд рекомендуемых элементов управления можно проверить надежность как Cre выражения и специфичности. Правильное выражение вашего Cre и ожидаемое иссечение Rpl22-HA можно определить несколькими методами. В первом, ткани, изолированные от экспериментальных животных могут быть окрашены для HA с помощью либо иммуногистохимии или иммунофлуоресценции15. Этот метод является оптимальным в том, что он не требует априорных знаний переведенных мРНК в типах целевых клеток. Второй метод, пример которого показан на рисунке 6,требует некоторых знаний о переводчески регулируемых сообщениях в типах целевых ячеек. В этом методе обогащение для известной переводно регулируемой мРНК может быть подтверждено выбранным Драйвером Cre,используя количественные ПЦР IPed по сравнению с входиной РНК. Аналогичным образом, надежное выражение Rpl22-HA может быть подтверждено сравнением образцов Cre/Rpl22 (положительный контроль) с cre-/Rpl22 или Cre/Rpl22- образцами, которые действуют как эффективные отрицательные элементы управления (см. рисунок 3). Эти сравнения могут быть сделаны либо по общей IPed РНК или обогащения для известных переводически регулируемых мРНК оценивается qRT-PCR или какой-либо другой количественный метод.
Общие проблемы при исполнении протокола, как правило, становятся очевидными только тогда, когда доходность РНК неожиданно низка яснее или высока. Наиболее распространенной причиной этих сбоев являются неправильные генотипирования лиц. Мы рекомендуем сохранить дополнительную ткань из собранного образца для подтверждения генотипов всех образцов в случае непредвиденных урожаев РНК. После подтверждения следует рассмотреть другие возможности, включая возможность загрязнения RNase или деградации образцов. Тщательное хранение образцов и обработка и обслуживание свободных зон RNase в лаборатории может значительно уменьшить или устранить эти проблемы. Хотя вопросы изоляции РНК являются еще одной потенциальной проблемой в этом протоколе, использование коммерческих комплектов значительно снижает эту проблему, хотя следует позаботиться о том, чтобы они были сохранены как RNase бесплатно и не содержат решений с истекшим сроком годности. Наконец, как и во всех антителах на основе процедур, изменения в партии, условия хранения, концентрации, или даже судоходства имеют потенциал, чтобы негативно повлиять на качество антитела и последующий успех вырубки. В результате, после тщательного и повторного тестирования, мы выбрали наиболее последовательные и эффективные антитела доступны.
Этот протокол содержит два основных изменения по сравнению с другими опубликованными протоколами RiboTag, которые значительно повышают вероятность успеха. Одним из них является возможность использования флэш замороженных тканей, тем самым смягчая любые проблемы, связанные с много, техник, или технические вариации запуска. Образцы могут быть собраны и сохранены, что позволяет изоляцию HA-рибосом ы от всех образцов одновременно, снижая то, что может быть основным источником вариации. Во-вторых, добавление преклирного шага существенно снижает фон, о который сообщают другие пользователи системы RiboTag. Недавно, протокол доклада Sanz et al. указывает на наличие высокого фона из-за обилия рибосомы связанных стенограмм изне-Cre-управляемыхклеток14. Наш протокол устраняет эту проблему, включая предочистный шаг, эффективно устраняя присутствие РНК в образцах ИС.
Как и все системы, следует иметь в виду присущие системе RiboTag ограничения. При использовании нехарактерных драйверов Cre, анализ экспрессии должен быть выполнен до экспериментального производства образца. С точки зрения перевода следует отметить несколько нюансов этого метода. Во-первых, RiboTag не допускает дифференциации между мРНК, готовых к переводу, и теми, кто активно переводит. Таким образом, современные методы, основанные на RiboTag, не позволяют количественно определить эффективность перевода как функцию отдельных мРНК. Если эффективность перевода представляет интерес, она может быть измерена на основе клеточной основе, если метод RiboTag сочетается с другими инструментами анализа транслатомов, такими как полисомное профилирование. Во-вторых, принципиально важно учитывать общие изменения изобилия РНК, вытекающие из индивидуальной или генотипной зависимости дисперсии. Именно по этой причине тщательная изоляция входной РНК сопровождает иммунопрециционные пробы, а образцы, полученные из каждого из них, остаются в паре на протяжении всех анализов вниз по течению. Наконец, и что касается анализа на основе RiboTag, следует помнить, что связь с рибосомой не обязательно доказывает перевод. Следует проводить вторичные методы анализа для подтверждения трансляционного регулирования целевых показателей, представляющих интерес.
Этот протокол описывает изоляцию рибосомных РНК от зародышевых клеток мышей мужского пола с использованием модели RiboTag. Не учитывая разведение мышей и сбор проб, протокол занимает два дня, с трех часов в первый день, лучше всего сделать во второй половине дня, ночная инкубация, а затем пять часов работы последующее утро. Настоятельно рекомендуется заранее готовить биржевые растворы (HB и HSWB), а также шлифовку тканей. Общий успех протокола зависит от правильного генотипирования и строго без RNase условий. Способность исследовать транслатом конкретных типов клеток позволит будущим исследованиям лучше понять взаимосвязь между транскрипцией, переводом и протеомом в бесчисленных типах клеток и мутантных фонах.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована грантом NIH NICHD R00HD083521 для EMS и внутренней поддержкой от Ратгерского университета до EMS.
1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
Dissection scissors | Preference of researcher | ||
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
Heat block | Preference of researcher | ||
Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |